RÈGLEMENT (CE) N° 1081/96 DE LA COMMISSION du 14 juin 1996 établissant une méthode de référence pour la détection de lait de vache et de caséinates dans les fromages à base de lait de brebis, de lait de chèvre ou de lait de bufflonne ou de mélanges de lait de brebis, de chèvre et de bufflonne et abrogeant le règlement (CEE) n° 690/92

LA COMMISSION DES COMMUNAUTÉS EUROPÉENNES,

vu le traité instituant la Communauté européenne,

vu le règlement (CEE) n° 804/68 du Conseil, du 27 juin 1968, portant organisation commune des marchés dans le secteur du lait et des produits laitiers (1), modifié en dernier lieu par le règlement (CE) n° 2931/95 de la Commission (2), et notamment son article 9 paragraphe 3, son article 16 paragraphes 1 et 4 et son article 17 paragraphe 14,

considérant qu'une aide au stockage privé des fromages à base de lait de brebis peut être octroyée en vertu du règlement (CEE) n° 508/71 du Conseil, du 8 mars 1971, établissant les règles générales régissant l'octroi d'aides pour le stockage privé de fromages de garde (3); qu'une restitution spéciale peut être octroyée pour les mêmes produits en vertu de l'article 17 du règlement (CEE) n° 804/68; qu'il est prévu d'importer dans la Communauté à partir de certains pays tiers dans des conditions préférentielles des fromages à base de lait de brebis, de lait de chèvre et de lait de bufflonne ou de mélanges de lait de brebis, de chèvre et de bufflonne;

considérant que, en raison des dispositions susvisées concernant les fromages à base de lait de brebis, de lait de chèvre ou de lait de bufflonne ou de mélanges de lait de brebis, de chèvre ou de bufflonne, il est nécessaire de vérifier par des contrôles appropriés qu'il n'a pas été incorporé de lait de vache dans les produits concernés; qu'il convient d'établir une méthode de référence communautaire de détection du lait de vache, sans préjudice de l'application de méthodes de routine si celles-ci sont conformes à certains critères;

considérant qu'une méthode de référence applicable aux fromages à base de lait de brebis, de lait de chèvre ou de lait de bufflonne ou de mélanges de lait de brebis, de chèvre et de bufflonne remplace la méthode de référence décrite dans le règlement (CEE) n° 690/92 de la Commission (4), qui peut donc être abrogé;

considérant que les mesures prévues au présent règlement sont conformes à l'avis du comité de gestion du lait et des produits laitiers,

A ARRÊTÉ LE PRÉSENT RÈGLEMENT:

Article premier

La méthode d'analyse de référence figurant en annexe est appliquée pour garantir que le fromage devant être produit exclusivement avec du lait de brebis, du lait de chèvre ou du lait de bufflonne ou un mélange de lait de brebis, de chèvre et de bufflonne ne contient pas de caséine de lait de vache.

La caséine de lait de vache est considérée comme présente si la teneur apparente en caséine de lait de vache de l'échantillon à analyser est égale ou supérieure à la teneur de l'échantillon de référence contenant 1 % de lait de vache, décrit en annexe.

Article 2

Les méthodes de routine pour la détection de la caséine de lait de vache dans les fromages visés à l'article 1er peuvent être utilisées dans les conditions suivantes:

- la limite de détection doit être de 0,5 % au maximum,

- il ne peut pas y avoir de résultats faux positifs. Si cette condition n'est pas remplie, tout échantillon donnant un résultat positif doit être analysé au moyen de la méthode de référence,

- la caséine de lait de vache doit être détectable avec la sensibilité requise, même après de longues périodes de maturation, comme cela peut se produire dans les conditions habituelles de l'exploitation commerciale. Si cette exigence n'est pas satisfaite pour un certain type de fromage visé à l'article 1er, ce fromage doit être analysé au moyen de la méthode de référence.

Article 3

Le règlement (CEE) n° 690/92 est abrogé. Toute référence au règlement (CEE) n° 690/92 est réputée comme une référence au présent règlement.

Article 4

Le présent règlement entre en vigueur le troisième jour suivant celui de sa publication au Journal officiel des Communautés européennes.

Il est applicable à partir du 1er octobre 1996.

Le présent règlement est obligatoire dans tous ses éléments et directement applicable dans tout État membre.

Fait à Bruxelles, le 14 juin 1996.

Par la Commission

Franz FISCHLER

Membre de la Commission

(1) JO n° L 148 du 28. 6. 1968, p. 13.

(2) JO n° L 307 du 20. 12. 1995, p. 10.

(3) JO n° L 58 du 11. 3. 1971, p. 1.

(4) JO n° L 74 du 20. 3. 1992, p. 23.

ANNEXE

MÉTHODE DE RÉFÉRENCE POUR LA DÉTECTION DE LAIT DE VACHE ET DE CASÉINATES DANS LES FROMAGES À BASE DE LAIT DE BREBIS, DE LAIT DE CHÈVRE OU DE LAIT DE BUFFLONNE OU DE MÉLANGES DE LAIT DE BREBIS, DE CHÈVRE ET DE BUFFLONNE

1. Objet

Détection de lait de vache et de caséinates dans les fromages à base de lait de brebis, de lait de chèvre, de lait de bufflonne ou de mélanges de lait de brebis, de chèvre et de bufflonne au moyen de la focalisation isoélectrique des caséines ã (gamma) après action de la plasmine

2. Champ d'application

Cette méthode convient pour la détection sensible et spécifique de lait de vache et de caséinates crus ou traités thermiquement dans les fromages frais et affinés à base de lait de brebis, de lait de chèvre, de lait de bufflonne ou de mélanges de lait de brebis, de chèvre et de bufflonne. Elle ne convient pas pour la détection du frelatage du lait et du fromage au moyen de concentrés de protéines de petit lait de vache traités thermiquement.

3. Principe de la méthode

3.1. Isolement des caséines du fromage et des échantillons de référence

3.2. Dissolution des caséines isolées et protéolyse par la plasmine (EC.3.4.21.7)

3.3. Focalisation isoélectrique des caséines soumises à l'action de la plasmine en présence d'urée et coloration des protéines

3.4. Interprétation des profils de caséine ã3 et ã2 (identification du lait de vache) par comparaison du profil obtenu pour l'échantillon avec celui obtenu sur le même gel pour les échantillons de référence contenant 0 et 1 % de lait de vache

4. Réactifs

Sauf indication contraire, les produits chimiques utilisés doivent être analytiquement purs. L'eau doit être bidistillée ou d'une pureté équivalente.

Remarque: les données suivantes s'appliquent à des gels de polyacrylamide préparés en laboratoire contenant de l'urée, de 265 × 125 × 0,25 mm. Si d'autres dimensions et types de gel sont utilisés, il peut être nécessaire d'ajuster les conditions de séparation.

Focalisation isoélectrique

4.1. Réactifs destinés à la production des gels de polyacrylamide contenant de l'urée

4.1.1. Solution «mère» ou solution «stock» du gel

Dissoudre:

4,85 g d'acrylamide

0,15 g N,N'-méthylène-bis-acrylamide (BIS)

48,05 g d'urée

15,00 g de glycérol (87 % m/m),

dans de l'eau, amener à 100 ml et conserver au frais dans une bouteille de verre brun.

Remarque: les quantités indiquées d'acrylamide neurotoxiques peuvent être remplacées par une solution d'acrylamide et bis-acrylamide prémélangés disponible dans le commerce. Dans le cas où la solution du commerce a une concentration de 30 % d'acrylamide et 0,8 % de bis-acrylamide, les quantités indiquées dans la préparation susmentionnée (4,85 g d'acrylamide et 0,15 g de BIS) doivent être remplacées par un volume de 16,2 ml de cette solution du commerce. La solution «stock» ne peut être conservée que dix jours au maximum. Si sa conductivité est supérieure à 5 ìS, il faut déioniser en mélangeant avec 2 g d'Amberlite MB-3 pendant 30 min, ensuite filtrer à travers une membrane de 0,45 ìm.

4.1.2. Solution de gel

Préparer une solution de gel en mélangeant des additifs et des ampholytes avec la solution «mère» ou solution «stock» de gel (4.1.1):

9,0 ml de solution de base de gel

24 mg de ß-alanine500 ìl d'ampholyte pH 3,5-9,5 (1)

250 ìl d'ampholyte pH 5-7 (2)

250 ìl d'ampholyte pH 6-8 (3).

Mélanger la solution de gel et la dégazer dans un bain à ultrasons ou sous vide pendant 2 à 3 min.

Remarque: la solution doit être préparée juste avant d'être coulée (6.2).

4.1.3. Catalyseurs

4.1.3.1. N, N, N', N'-tétraméthylènediamine (TEMED)

4.1.3.2. 40 % de persulfate d'ammonium (PER)

Dissoudre 800 mg de PER dans de l'eau et porter à 2 ml.

Remarque: utiliser toujours une solution de PER fraîchement préparée.

4.2. Liquide de contact

Kérosène ou paraffine liquide

4.3. Solution anodique

Ajouter de l'eau à 5,77 g d'acide phosphorique (85 % m/m) jusqu'à obtention d'un volume de 100 ml.

4.4. Solution cathodique

Dissoudre 2,00 g d'hydroxyde de sodium dans de l'eau jusqu'à obtention d'un volume de 100 ml.

Préparation des échantillons

4.5. Réactifs destinés à l'isolement (ou extraction) des protéines

4.5.1. Solution diluée d'acide acétique (25 ml d'acide acétique cristallisable complété à 100 ml avec de l'eau distillée)

4.5.2. Dichlorométhane

4.5.3. Acétone

4.6. Solution tampon de dissolution des protéines

Dissoudre:

5,75 g de glycérol (87 % m/m)

24,03 g d'urée

250 mg de dithiothréitol,

dans de l'eau distillée jusqu'à obtention d'un volume de 50 ml.

Remarque: stocker au frais. La solution se conserve une semaine au maximum.

4.7. Réactifs destinés à la protéolyse due à la plasmine

4.7.1. Tampon de carbonate d'ammonium

Ajuster jusqu'à pH 8 une solution d'hydrogénocarbonate d'ammonium à 0,2 mol/l (1,58 g/100 ml d'eau) contenant 0,05 mol/l d'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA, 1,46 g/100 ml) à l'aide d'une solution de carbonate d'ammonium à 0,2 mol/l (1,92 g/100 ml d'eau) contenant 0,05 mol/l d'EDTA.

4.7.2. Plasmine bovine (E.C. 3.4.21.7), au minimum 5 U/ml

4.7.3. Solution d'acide å-aminocaproïque destinée à l'inhibition de l'enzyme

Dissoudre 2,624 g d'acide å-aminocaproïque (acide amino 6 n-hexanoïque) dans 100 ml d'éthanol à 40 % (v/v).

4.8. Échantillons de référence

4.8.1. Des échantillons de référence certifiés d'un mélange de lait écrémé de brebis et de chèvre emprésuré contenant 0 et 1 % de lait de vache peuvent être obtenus auprès de l'institut des matériaux et des mesures de référence de la Commission à B-2440 Geel.

4.8.2. Préparation des échantillons de référence intérimaires de laboratoire de lait de bufflonne emprésuré contenant 0 et 1 % de lait de vache

Le lait est préparé par centrifugation de lait de bufflonne ou de vache cru à 37 °C (2 500 g, 20 min). Refroidir le tube et son contenu rapidement à 6-8 °C, puis éliminer complètement la couche de matières grasses rassemblée en surface. Pour la préparation d'un échantillon de référence de 1 %, ajouter 5,00 ml de lait de vache écrémé à 495 ml de lait de bufflonne écrémé dans un bécher de 1 l et ajuster le pH à 6,4 en ajoutant de l'acide lactique dilué à 10 % v/v. Ajuster la température à 35 °C et ajouter 100 ìl de présure de veau (1: 10 000, environ 3 000 U/ml), mélanger pendant 1 min, puis couvrir le bécher d'une feuille d'aluminium et laisser reposer à 35 °C pendant une heure pour laisser le caillé se former. Après formation du caillé, le lait en présuré est entièrement lyophilisé sans homogénéisation préalable et égouttage du lactosérum. Le lait lyophilisé est finement broyé en une poudre homogène. Pour la préparation de l'échantillon de référence de 0 %, suivre la même procédure avec du lait écrémé pur de bufflonne. Stocker les échantillons de référence à - 20 °C.

Remarque: il est recommandé de vérifier la pureté du lait de bufflonne par focalisation isoélectrique des caséines soumises à l'action de la plasmine avant la préparation des échantillons de référence.

Réactifs destinés à la coloration des protéines

4.9. Fixateur

Dissoudre 150 ml d'acide trichloroacétique dans de l'eau jusqu'à obtention d'un volume de 1 000 ml.

4.10. Solution de décoloration

Mélanger 500 ml de méthanol et 200 ml d'acide acétique cristallisable avec de l'eau distillée et amener à 2 000 ml.

Remarque: renouveler quotidiennement la solution de décoloration; elle peut être préparée par mélange à volume égal d'une solution «stock» de méthanol à 50 % (v/v) et d'une solution «stock» d'acide acétique cristallisable à 20 % (v/v).

4.11. Solutions de coloration

4.11.1 Solution de coloration (solution «stock» 1)

Dissoudre 3,0 g de bleu brillant G 250 de Coomassie (C.I. 42655) dans 1 000 ml de méthanol à 90 % (v/v) au moyen d'un agitateur magnétique (environ 45 min, passer la solution à travers deux filtres plissés.

4.11.2. Solution de coloration (solution «stock» 2)

Dissoudre 5,0 g de sulfate de cuivre pentahydraté dans 1 000 ml d'acide acétique à 20 % (v/v).

4.11.3. Solution de coloration (prête à l'emploi)

Mélanger 125 ml de chaque solution «stock» (4.11.1, 4.11.2) immédiatement avant la coloration.

Remarque: la solution de coloration prête à l'emploi doit être utilisée le jour de sa préparation.

5. Appareillage et accessoires

5.1. Plaques de verre (265 × 125 × 4 mm); rouleau en caoutchouc d'une largeur de 15 cm; table à niveau réglable

5.2. Feuille de support de gel (265 × 125 mm)5.3. Seconde feuille (280 × 125 mm). Coller sur les deux longueurs de cette feuille une bande de ruban adhésif de 280 × 6 × 0,25 mm (figure 1)

5.4. Cuve d'électrofocalisation à plaque de refroidissement (par exemple 265 × 125 mm) et générateur de tension approprié (≥ 2,5 kV) ou appareil automatique d'électrophorèse

5.5. Cryostat à circulation, maintenu à la température de 12 ± 0,5 °C

5.6. Centrifugeuse réglable à 3 000 g

5.7. Bandes de papier pour électrodes (≥ 265 mm de long)

5.8. Flacons compte-gouttes en matière synthétique pour les solutions anodique et cathodique

5.9. Applicateurs d'échantillons 10 × 5 mm (viscose ou papier filtre à faible absorption des protéines)

5.10. Ciseaux, scalpels et pincettes en acier inoxydable

5.11. Cuves de coloration et de décoloration en acier oxydable (par exemple, cuves d'une dimension de 280 × 150 mm)

5.12. Homogénéisateur réglable (tige de 10 mm de diamètre), vitesse de rotation de 8 000 à 20 000 tours

5.13. Agitateur magnétique

5.14. Bain à ultrasons

5.15. Appareil de soudure des feuilles

5.16. Pipettes graduées en microlitres (de 5 à 25 ìl)

5.17. Centrifugeuse sous vide ou appareil de lyophilisation

5.18. Bain-marie réglable à 35 et 40 ± 1 °C à dispositif d'agitation

5.19. Densitomètre (lecture à une longueur d'onde de 634 nm)

6. Mode opératoire

6.1. Préparation des échantillons

6.1.1. Extraction ou isolement des caséinesIntroduire l'équivalent de 5 g de matière sèche de fromage ou d'échantillon de référence dans un tube de centrifugation de 100 ml, ajouter 60 ml d'eau distillée et homogénéiser à l'aide de l'homogénéisateur (8 000 à 10 000 tours/min). Ajuster à un pH de 4,6 à l'aide d'un solution d'acide acétique dilué (4.5.1) et centrifuger (5 min, 3 000 g). Éliminer les matières grasses et la phase sérique; homogénéiser le culot de centrifugation à 20 000 tours/min dans 40 ml d'eau distillée ajustée à pH 4,5 à l'aide de la solution d'acide acétique dilué (4.5.1). Ajouter 20 ml de dichlorométhane (4.5.2), homogénéiser de nouveau et centrifuger (5 à 3 000 g). Éliminer la couche de caséine se trouvant entre la phase aqueuse et la phase organique (figure 2) à l'aide d'une spatule et éliminer les deux phases. Homogénéiser de nouveau la caséine dans 40 ml d'eau distillée (voir ci-dessus) et 20 ml de dichlorométhane (4.5.2) et centrifuger. Répéter ce processus jusqu'à ce que la coloration des phases d'extraction devienne négligeable (deux ou trois fois). Homogénéiser le résidu de protéines avec 50 ml d'acétone (4.5.3) et filtrer la solution sur un filtre plissé. Laver le résidu deux fois avec 25 ml d'acétone sur le filtre et laisser sécher à l'air ou sous un courant d'azote; réduire ensuite en fines particules dans un mortier.

Remarque: les extraits protéiques séchés doivent être conservés à -20 °C.

6.1.2. Transformation des caséines ß en caséines ã par action de la plasmine

Mettre en suspension 25 mg de caséines isolées (6.1.1) dans 0,5 ml de tampon de carbonate d'ammonium (4.7.1) et homogénéiser pendant 20 min en utilisant, par exemple, le traitement ultrasonique. Porter à 40 °C et ajouter 10 ìl de plasmine (4.7.2); mélanger et incuber pendant une heure à 40 °C sans cesser d'agiter. Pour inhiber l'enzyme, ajouter 20 ìl de solution d'acide å-aminocaproïque (4.7.3), puis ajouter 200 mg d'urée et 2 mg de dithiothréitol.

Remarque: pour obtenir une meilleure symétrie des bandes de caséine focalisées, il est recommandé de lyophiliser la solution après avoir ajouté l'acide å-aminocaproïque et dissous les lyophilisats obtenus dans 0,5 ml de solution tampon (4.6).

6.2. Préparation des gels de polyacrylamide contenant de l'urée

Appliquer au rouleau, sur une plaque de verre (5.1) la feuille de support du gel (5.2) à l'aide de quelques gouttes d'eau; éponger l'eau excédentaire avec une serviette de papier. De la même manière, appliquer au rouleau la seconde feuille (5.3), pourvue de ruban adhésif (écarteurs de 0,25 mm), sur une autre plaque de verre. Cette seconde plaque est posée horizontalement sur une table à niveau réglable.

Ajouter à la solution de gel préparée et dégazée (4.1.2) 10 ìl de TEMED (4.1.3.1); la mélanger soigneusement et la verser rapidement et uniformément au centre de la seconde sur la plaque de la seconde feuille et l'abaisser lentement jusqu'à ce qu'un film de gel se forme et s'étende uniformément, sans inclusion de bulles, entre les feuilles (figure 3). À l'aide d'une fine spatule, abaisser soigneusement et complètement la plaque de support du gel et y poser, pour faire pression, trois autres plaques de verre. Après polymérisation complète (environ 60 min), récupérer en même temps le gel polymérisé sur la feuille de support du gel ainsi que sur l'autre feuille en écartant les deux plaques de verre. Nettoyer soigneusement le dos de la feuille de support des restes de gel et de l'urée. Souder entre eux les bords du «sandwich de gel» dans le sens de la longueur; on obtient ainsi un tube que l'on peut conserver au réfrigérateur (six semaines au maximum).

Remarque: la seconde feuille avec les écarteurs peut être réutilisée. Le gel de polyacrylamide peut être découpé en plus petits formats; ceci est recommandé en cas d'échantillonnages restreints ou en cas d'utilisation d'un appareil automatique d'électrophorèse (2 gels de format 4,5 × 5 cm).

6.3. Focalisation isoélectrique

Régler le cryostat à 12 °C. Essuyer le dos de la feuille de support du gel à l'aide de kérosène, verser quelques gouttes de kérosène (4.2) au centre du bloc de refroidissement. Appliquer le «sandwich de gel» en éliminant les bulles d'air, côté support vers le bas. Essuyer l'excédent de kérosène et retirer la seconde feuille. Imbiber les bandes des solutions anodique et cathodique (4.3 et 4.4), les couper à la longueur du gel et les mettre en place (distance des électrodes: 9,5 cm).

Procéder à la focalisation dans les conditions suivantes.

6.3.1. Format du gel: 265 × 125 × 0,25 mm

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Remarque: si l'épaisseur ou la largeur des gels change, les valeurs du courant et de la puissance doivent être adaptées (par exemple, doubler les valeurs du courant et de la puissance en cas d'utilisation d'un gel de format 265 × 125 × 0,5).

6.3.2. Exemple de programmation d'un appareil automatique d'électrophorèse (2 gels de 5,0 × 4,5 cm): placer les électrodes sans bande directement sur le gel

>TABLE>

Placer l'applicateur d'échantillons à l'étape 2 à 00 Vh.

Ôter l'applicateur d'échantillons à l'étape 2 à 30 Vh.

6.4. Coloration des protéines

6.4.1. Fixation des protéines

Après avoir coupé le courant, retirer immédiatement les bandes et placer le gel dans une cuve de coloration/décoloration remplie de 200 ml de fixateur (4.9); laisser reposer 15 min en agitant continuellement.

6.4.2. Lavage et coloration de la plaque de gel

Décanter soigneusement le fixateur et procéder à deux lavages de 30 secondes de la plaque de gel avec 100 ml de solution de décoloration (4.10). Décanter la solution de décoloration, remplir la cuve avec 250 ml de solution de coloration (4.11.3) et procéder à la coloration pendant 45 min en agitant légèrement.

6.4.3. Décoloration de la plaque de gel

Décanter la solution de coloration et procéder à deux lavages de la plaque de gel avec 100 ml de solution de décoloration (4.10), agiter ensuite deux fois pendant 15 min avec 200 ml de solution de décoloration et répéter l'étape de décoloration au moins deux à trois fois jusqu'à ce que le fond devienne clair et perde sa coloration. Laver ensuite la plaque de gel avec de l'eau distillée (deux fois 2 min) et sécher à l'air (2 à 3 heures) ou à l'aide d'un sèche-cheveux (de 10 à 15 min).

Remarque 1: effectuer les opérations de fixation, de lavage, de coloration et de décoloration à 20 °C. Ne pas utiliser de température élevée.

Remarque 2: si la préférence est donnée à une coloration à l'argent plus sensible (par exemple, Silver Staining Kit, Protein, Pharmacia Biotech, Code n° 17-1150-01), diluer à 5 mg/ml les échantillons de caséine à traiter à la plasmine.

7. Interprétation des résultats

L'interprétation des résultats se fait en comparant le profil des protéines de l'échantillon à examiner avec ceux des échantillons de référence sur le même gel. Le lait de vache est détecté dans les fromages de lait de brebis, dans le lait de chèvre et le lait de bufflonne et les mélanges de lait de brebis, de chèvre et de bufflonne par la mise en évidence des caséines ã2 et ã3 dont les points isoélectriques se situent entre pH 6,5 et 7,5 (figures 4a, b, figure 5). La limite de détection est inférieure à 0,5 %.

7.1. Interprétation visuelle.

Pour une interprétation visuelle de la quantité de lait de vache, il est recommandé d'adapter les concentrations d'échantillons et d'échantillons de référence afin d'obtenir le même degré d'intensité des caséines ã2 et ã3 de lait de brebis, de chèvre et/ou de bufflonne («ã2 E,G,B» et «ã3 E,G,B» dans les figures 4a,b et 5). Ensuite, la quantité de lait de vache (inférieure, égale ou supérieure à 1 %) dans l'échantillon à examiner peut être jugée directement par comparaison de l'intensité des caséines ã3 et ã2 du lait de vache (voir «ã3 C» et «ã2 C» dans les figures 4a,b et 5) avec celles des échantillons de référence à 0 et 1 % (brebis, chèvre) ou des échantillons intérimaires de laboratoire (bufflonne).

7.2. Estimation densitométrique

Si possible, appliquer la densitométrie (5.19) pour la détermination du rapport de la surface de pic entre les caséines ã2 et ã3 du lait de vache et du lait de brebis, du lait de chèvre et/ou du lait de bufflonne (figure 5). Comparer cette valeur avec le rapport de la surface de pic des caséines ã2 et ã3 de l'échantillon de référence à 1 % (lait de brebis, lait de chèvre) ou de l'échantillon de référence intérimaire de laboratoire (lait de bufflonne) analysés sur le même gel.

Remarque: cette méthode fonctionne de façon satisfaisante s'il existe un signal nettement positif pour les deux caséines ã2 et ã3 de lait de vache dans l'échantillon de référence à 1 % mais non dans l'échantillon de référence à 0 %. Dans le cas contraire, optimiser la procédure en suivant soigneusement les instructions de la méthode.

Un échantillon est jugé positif si les deux caséines ã2 et ã3 de lait de vache ou les rapports de surface de pic correspondants sont égaux ou supérieurs aux chiffres concernant l'échantillon de référence à 1 %.

8. Références

1. Addeo F., Moio L., Chianese L., Stingo C., Resmini P., Berner I., Krause I., Di Luccia A., Bocca A.: Use of plasmin to increase the sensitivity of the detection of bovine milk in ovine and/or caprine cheese by gel isoelectric focusing of ã2-caseins. Milchwissenschaft 45, 708-711 (1990).

2. Addeo F., Nicolai M.A., Chianese L., Moio L., Spagna Musso S., Bocca A., Del Giovine L.: A control method to detect bovine milk in ewe and water buffalo cheese using immunoblotting. Milchwissenschaft 50, 83-85 (1995).

3. Krause I., Berner I., Klostermeyer H.: Sensitive detection of cow milk in ewe and goat milk and cheese by carrier ampholyte - and carrier ampholyte/immobilised pH gradient - isoelectric focusing of ã-caseins using plasmin as signal amplifier. in: Electrophoresis-Forum 89 (B. J. Radola, ed.) pp. 389-393, Bode-Verlag, München (1989).

4. Krause I., Belitz H.-D., Kaiser K.-P.: Nachweis von Kuhmilch in Schaf- und Ziegenmilch bzw. -käse durch isoelektrische Fokussierung in harnstoffhaligen Polyacrylamidgelen. Z. Lebensm. Unters. Forsch. 174, 195-199 (1982).

5. Radola B.J.: Ultrathin-layer isoelectric focusing in 50-100 ìm polyacrylamide gels on silanised glass plates or polyester films. Electrophoresis 1, 43-56 (1980).

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Figure 1: dessin schématique de la seconde feuille

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Figure 2: couche de caséine surnageante entre la phase aqueuse et la phase organique après centrifugation

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Figure 3: technique de rabat pour la coulée de gels de polyacrylamide ultrafin

a = écarteur (0,25 mm); b = seconde feuille (5.3); c, e = plaques de verre (5.1); d = solution de gel (4.1.2); f = feuille de support de gel (5.2)

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Figure 4a: focalisation isoélectrique des caséines de fromage de lait de brebis et de lait de chèvre contenant différentes quantités de lait de vache, soumises à l'action de la plasmine

% CM = pourcentage de lait de vache; C = vache; S = brebis; G = chèvre

La moitié supérieure du gel FIE est indiquée.

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Figure 4b: focalisation isoélectrique des caséines de fromage produits à partir de mélanges de lait de brebis, de chèvre et de bufflonne contenant différentes quantités de lait de vache, soumises à l'action de la plasmine

% CM = pourcentage de lait de vache; 1+ = échantillon contenant 1 % de lait de vache et dopé de caséine pure de lait de vache au milieu du trajet; C = vache; E = brebis; G = chèvre; B = bufflonne.

La distance totale de séparation du gel FIE est indiquée.

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Figure 5: superposition des densitogrammes des échantillons de référence (STD) et des échantillons de fromage produits à partir d'un mélange de lait de brebis et de lait de chèvre après focalisation isoélectrique.

a, b = échantillons de référence contenant 0 et 1 % de lait de vache; c-g = échantillons de fromage contenant 0, 1, 2, 3 et 7 % de lait de vache; C = vache; E = brebis; G = chèvre.

La moitié supérieure du gel a été lue à une longueur d'onde ë = 634 nm.

(1) Les produits Ampholine pH 3,5-9,5 (Pharmacia) et Resolyte pH 5-7 et pH 6-8 (BDH, Merck) se révèlent particulièrement efficaces pour obtenir la résolution de la ã-caséine.