Eighth Commission Directive 78/633/EEC of 15 June 1978 establishing Community methods of analysis for the official control of feedingstuffs
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  • Directive de la Commissiondu 30 juillet 1981modifiant les directives 71/250/CEE, 71/393/CEE, 72/199/CEE, 73/46/CEE, 74/203/CEE, 75/84/CEE, 76/372/CEE et 78/633/CEE portant fixation de méthodes d'analyse communautaires pour le contrôle officiel des aliments des animaux(81/680/CEE), 31981L0680, 29 août 1981
  • Directive de la Commissiondu 20 décembre 1983modifiant les directives 71/393/CEE, 72/199/CEE et 78/633/CEE portant fixation de méthodes d'analyse communautaires pour le contrôle officiel des aliments des animaux(84/4/CEE), 31984L0004, 18 janvier 1984
  • Règlement (CE) no 152/2009 de la Commissiondu 27 janvier 2009portant fixation des méthodes d'échantillonnage et d'analyse destinées au contrôle officiel des aliments pour animaux(Texte présentant de l'intérêt pour l'EEE), 32009R0152, 26 février 2009
Huitième directive de la Commissiondu 15 juin 1978portant fixation de méthodes d'analyse communautaires pour le contrôle officiel des aliments des animaux(78/633/CEE) LA COMMISSION DES COMMUNAUTÉS EUROPÉENNES, vu le traité instituant la Communauté économique européenne, vu la directive 70/373/CEE du Conseil, du 20 juillet 1970, concernant l'introduction de modes de prélèvement d'échantillons et de méthodes d'analyses communautaires pour le contrôle officiel des aliments des animauxJO no L 170 du 3. 8. 1970, p. 2., modifiée en dernier lieu par l'acte d'adhésion, et notamment son article 2, considérant que la directive susvisée prévoit que les contrôles officiels des aliments des animaux visant à constater que les conditions prescrites en vertu des dispositions législatives, réglementaires ou administratives concernant la qualité et la composition des aliments des animaux sont respectées, sont effectuées selon des modes de prélèvement d'échantillons et des méthodes d'analyse communautaires; considérant que les directives de la Commission 71/250/CEE du 15 juin 1971JO no L 155 du 12. 7. 1971, p. 13., 71/393/CEE du 18 novembre 1971JO no L 279 du 20. 12. 1971, p. 7., 72/199/CEE du 27 avril 1972JO no L 123 du 29. 5. 1972, p. 6., 73/46/CEE du 5 décembre 1972JO no L 83 du 30. 3. 1973, p. 21., 74/203/CEE du 25 mars 1974JO no L 108 du 22. 4. 1974, p. 7., 75/84/CEE du 20 décembre 1974JO no L 32 du 5. 2. 1975, p. 26. et 76/372/CEE du 1er mars 1976JO no L 102 du 15. 4. 1976, p. 8. ont déjà fixé un certain nombre de méthodes d'analyse communautaires; que, compte tenu de l'état d'avancement des travaux effectués depuis lors, il convient d'arrêter une huitième série de méthodes; considérant que les mesures prévues à la présente directive sont conformes à l'avis du comité permanent des aliments des animaux, A ARRÊTE LA PRÉSENTE DIRECTIVE:
Article premier 1. Les États membres prescrivent que les analyses pour les contrôles officiels des aliments des animaux, en ce qui concerne leur teneur en bacitracine-zinc, flavophospholipol, fer, cuivre, manganèse et zinc, sont effectuées selon les méthodes décrites à l'annexe de la présente directive. 2. Les dispositions générales figurant à la partie 1 "Introduction" de l'annexe de la première directive 71/250/CEE, à l'exception de la partie concernant la préparation de l'échantillon à analyser, sont applicables aux méthodes décrites à l'annexe de la présente directive.
Article 2 Les États membres mettent en vigueur, le 1er janvier 1979, les dispositions législatives, réglementaires ou administratives nécessaires pour se conformer aux dispositions de la présente directive. Ils en informent immédiatement la Commission.
Article 3 Les États membres sont destinataires de la présente directive.
null ANNEXE 1.DOSAGE DE LA BACITRACINE-ZINC — par diffusion sur gélose — 1.OBJET ET DOMAINE D'APPLICATION La méthode permet de doser la bacitracine-zinc dans les aliments et les prémélanges. La limite inférieure du dosage est de 5 mg/kg (5 ppm)1 mg de bacitracine-zinc (qualité pour aliments des animaux) équivaut à 42 unités internationales (UI).. 2.PRINCIPE L'échantillon est extrait à pH 2 par un mélange de méthanol, d'eau et d'acide chlorhydrique et une solution de sulfure de sodium. Le sulfure de sodium permet de précipiter les sels de cuivre solubles pouvant interférer dans la détermination. L'extrait amené à pH 6,5 est concentré (si nécessaire) et dilué. Son activité antibiotique est déterminée par mesure de la diffusion de la bacitracine-zinc dans un milieu gélosé, ensemencé avec Micrococcus luteus (flavus). La diffusion se révèle par la formation de zones d'inhibition du micro-organisme. Le diamètre de ces zones est considéré comme étant directement proportionnel au logarithme de la concentration en antibiotique pour la gamme des concentrations utilisées. 3.MICRO-ORGANISME: "MICROCOCCUS LUTEUS (FLAVUS)" ATCC 10240 3.1.Entretien de la souche Ensemencer le milieu de culture (4.1), en tubes inclinés, par Micrococcus luteus (flavus). Incuber pendant vingt-quatre heures à 30 °C, conserver en réfrigérateur à 4 °C environ et renouveler l'ensemencement tous les quinze jours. 3.2.Préparation de la suspension bactérienneD'autres méthodes peuvent être utilisées dans la mesure où il est prouvé qu'elles produisent des suspensions bactériennes analogues. Récolter les germes d'un tube de gélose (3.1), de préparation récente, à l'aide de 2 à 3 ml de solution de chlorure de sodium (4.3). Ensemencer avec cette suspension 250 ml du milieu de culture (4.1) dans une fiole de Roux et incuber pendant dix-huit à vingt heures à 30 °C. Récolter les germes dans 25 ml de solution de chlorure de sodium (4.3) et homogénéiser.Diluer la suspension à 1/10 à l'aide de la solution de chlorure de sodium (4.3). La transmission lumineuse de la suspension, mesurée à 650 nm sous une épaisseur de 1 cm par comparaison avec la solution de chlorure de sodium (4.3), doit être de 75 % environ. Cette suspension peut être conservée une semaine à 4 °C environ. 4.MILIEUX DE CULTURE ET RÉACTIFS 4.1.Milieu d'entretien de la soucheTout milieu de culture commercial de composition analogue et donnant les mêmes résultats peut être utilisé.
Peptone de viande 6,0 g
Tryptone 4,0 g
Extrait de levure 3,0 g
Extrait de viande 1,5 g
Glucose 1,0 g
Gélose 10,0 à 20,0 g
Eau 1000 ml
pH 6,5-6,6 (après stérilisation)
4.2.Milieu de base du dosageTout milieu de culture commercial de composition analogue et donnant les mêmes résultats peut être utilisé.
Tryptone 10,0 g
Extrait de levure 3,0 g
Extrait de viande 1,5 g
Glucose 1,0 g
Gélose 10,0 à 20,0 g
Tween 80 1 ml
Eau 1000 ml
pH 6,5 (après stérilisation)
4.3. Solution à 0,8 % (p/v) de chlorure de sodium: dissoudre dans l'eau 8 g de chlorure de sodium, diluer à 1000 ml et stériliser. 4.4. Mélange de méthanol/eau/acide chlorhydrique (4.6): 80/17,5/2,5 (v/v/v). 4.5.Tampon phosphate, pH 6,5
Phosphate bipotassique K2HPO4 22,15 g
Phosphate monopotassique KH2PO4 27,85 g
Eau jusqu'à 1000 ml
 4.6. Acide chlorhydrique, d: 1,18-1,19 4.7. Acide chlorhydrique, 0,1 M 4.8. Solution 1 M d'hydroxyde de sodium 4.9. Solution 0,5 M environ de sulfure de sodium 4.10. Solution à 0,04 % (p/v) de pourpre de bromocrésol:dissoudre 0,1 g de pourpre de bromocrésol dans 18,5 ml de solution 0,01 M d'hydroxyde de sodium. Compléter à 250 ml avec de l'eau et homogénéiser. 4.11. Substance étalon: bacitracine-zinc d'activité connue (en UI). 5.SOLUTIONS ÉTALONS Peser une quantité de substance étalon (4.11) correspondant à 1050 UI (selon le titre indiqué). Ajouter 5 ml d'acide chlorhydrique 0,1 M (4.7) et laisser reposer quinze minutes. Ajouter 30 ml d'eau, ajuster le pH à 4,5 à l'aide du tampon phosphate (4.5) (4 ml environ), compléter à 50 ml avec de l'eau et homogénéiser (1 ml = 21 UI).Préparer à partir de cette solution et par dilutions successives à l'aide du tampon phosphate pH 6,5 (4.5) les solutions suivantes:
S8 0,42 UI/ml
S4 0,21 UI/ml
S2 0,105 UI/ml
S1 0,0525 UI/ml
 6.PRÉPARATION DE L'EXTRAIT 6.1.Extraction 6.1.1.Prémélanges et aliments minéraux Peser une quantité d'échantillon de 2,0 à 5,0 g, ajouter 29,0 ml du mélange (4.4) et 1,0 ml de solution de sulfure de sodium (4.9); agiter brièvement. Vérifier que le pH est de 2 environ. Agiter durant dix minutes, ajouter 30 ml de tampon phosphate (4.5), agiter durant quinze minutes et centrifuger. Prélever une partie aliquote de la solution surnageante et amener le pH à 6,5 à l'aide de la solution 1 M d'hydroxyde de sodium (4.8) en utilisant un pH-mètre ou la solution de pourpre de bromocrésol (4.10) comme indicateur.Diluer à l'aide du tampon phosphate (4.5) pour obtenir une concentration présumée en bacitracine-zinc de 0,42 UI/ml (= U8). 6.1.2.Concentrés protéiniques Peser une quantité d'échantillon de 10,0 g, ajouter 49,0 ml du mélange (4.4) et 1,0 ml de la solution de sulfure de sodium (4.9); agiter brièvement. Vérifier que le pH est de 2 environ. Agiter durant dix minutes, ajouter 50 ml du tampon phosphate (4.5), agiter durant quinze minutes et centrifuger. Prélever une partie aliquote de la solution surnageante et amener le pH à 6,5 à l'aide de la solution 1 M d'hydroxyde de sodium (4.8) en utilisant un pH-mètre ou la solution de pourpre de bromocrésol (4.10) comme indicateur.Évaporer approximativement la moitié du volume dans un évaporateur rotatif à une température ne dépassant pas 35 °C. Diluer à l'aide du tampon phosphate (4.5) pour obtenir une concentration présumée en bacitracine-zinc de 0,42 UI/ml (= U8). 6.1.3.Autres aliments Peser une quantité d'échantillon de 10,0 g (20,0 g pour une concentration présumée en bacitracine-zinc zinc de 5 mg/kg). Ajouter 24,0 ml du mélange (4.4) et 1,0 ml de la solution de sulfure de sodium (4.9); homogénéiser durant dix minutes. Ajouter 25 ml de tampon phosphate (4.5), agiter durant quinze minutes et centrifuger. Prélever 20 ml de la solution surnageante et ajuster le pH à 6,5 à l'aide de la solution 1 M d'hydroxyde de sodium (4.8) en utilisant un pH-mètre ou la solution de pourpre de bromocrésol (4.10) comme indicateur. Évaporer jusqu'à 4 ml environ dans un évaporateur rotatif à une température ne dépassant pas 35 °C. Diluer le résidu à l'aide du tampon phosphate (4.5) pour obtenir une concentration présumée en bacitracine-zinc de 0,42 UI/ml (= U8). 6.2.Solutions de l'extrait Préparer à partir de la solution U8 et par dilutions successives (1 + 1) à l'aide du tampon phosphate (4.5), les solutions U4 (concentration présumée: 0,21 UI/ml), U2 (concentration présumée: 0,105 UI/ml) et U1 (concentration présumée: 0,0525 UI/ml). 7.MODALITÉS DU DOSAGE 7.1.Inoculation du milieu de culture Ensemencer à 50 °C environ le milieu de base du dosage (4.2) par la suspension bactérienne (3.2). Par des essais préliminaires sur plaques avec le milieu (4.2), déterminer la quantité de suspension bactérienne permettant d'obtenir pour les différentes concentrations en bacitracine-zinc des zones d'inhibition aussi étendues que possible et qui soient encore nettes. 7.2.Préparation des boîtes La diffusion sur gélose s'effectue dans des boîtes avec les quatre concentrations de la solution étalon (S8, S4, S2, S1) et les quatre concentrations de l'extrait (U8, U4, U2, U1).Chaque boîte doit nécessairement recevoir les quatre concentrations de l'étalon et de l'extrait. À cet effet, choisir la dimension des boîtes de telle sorte qu'on puisse creuser dans le milieu gélosé au moins huit cavités de 10 à 13 mm de diamètre, dont les centres ne sont pas distants de moins de 30 mm. On peut utiliser comme boîtes des plaques de verre planes, surmontées d'un anneau d'aluminium ou de matière plastique de 200 mm de diamètre et 20 mm de hauteur.Introduire dans les boîtes une quantité du milieu (4.2), ensemencé comme indiqué en 7.1, permettant d'obtenir une couche de 2 mm environ d'épaisseur (60 ml pour une boîte de 200 mm de diamètre). Laisser solidifier, creuser les cavités et y déposer des volumes exactement mesurés des solutions de l'étalon et de l'extrait (0,10 à 0,15 ml par cavité, selon le diamètre). Faire au moins quatre répétitions de chaque concentration de façon que chaque détermination fasse l'objet d'une évaluation de 32 zones d'inhibition. 7.3.Incubation Incuber les boîtes pendant seize à dix-huit heures à 30 °C ± 2 °C. 8.ÉVALUATION Mesurer le diamètre des zones d'inhibition à 0,1 mm près. Pour chaque concentration, enregistrer les mesures moyennes sur papier semi-logarithmique en portant le logarithme des concentrations en regard des diamètres des zones d'inhibition. Tracer les droites les mieux ajustées pour la solution étalon et pour l'extrait en procédant, par exemple, comme suit:Déterminer le point le plus approprié du niveau le plus bas de la solution étalon (SL) à l'aide de la formule: (a) SL = 7s1 + 4s2 + s4 - 2s810 Déterminer le point le plus approprié du niveau le plus élevé de la solution étalon (SH) à l'aide de la formule: (b) SH = 7s8 + 4s4 + s2 - 2s110 Déterminer de la même façon les points les plus appropriés de l'extrait pour le niveau le plus bas (UL) et le niveau le plus élevé (UH) en remplaçant S1, S2, S4 et S8 dans les formules susmentionnées par U1, U2, U4 et U8.Inscrire les valeurs SL et SH sur le même graphique. En joignant les deux points on obtient la droite la mieux ajustée pour la solution étalon. En procédant de la même façon pour UL et UH on obtient la droite la mieux ajustée pour l'extrait.En l'absence de toute interférence, les droites devraient être parallèles. En pratique, on les considère comme étant parallèles lorsque (SH — SL) et (UH — UL) ne diffèrent par de plus de 10 % de leur moyenne.Si les droites ne sont pas parallèles, on peut éliminer soit U1 et S1, soit U8 et S8. Les valeurs SL, SH, UL et UH permettant d'obtenir les droites les mieux ajustées sont alors calculées à l'aide des formules suivantes:
(a′) SL = 5s1 + 2s2 - s46 ou 5s2 + 2s4 - s86
(b′) SH = 5s4 + 2s2 - s16 ou 5s8 + 2s4 - s26
et de formules analogues pour UL et UH. L'utilisation de cette alternative impose que les mêmes critères de parallélisme soient respectés. L'obtention d'un résultat provenant de trois niveaux doit être mentionnée sur le bulletin d'analyse.Lorsque les droites sont considérées comme étant parallèles, calculer le logarithme de l'activité relative (log. A) par l'une des formules ci-après, selon le nombre de niveaux (4 ou 3) utilisés pour l'évaluation du parallélisme.Pour 4 niveaux: (c) log. A = u1 + u2 + u4 + u8 - s1 - s2 - s4 - s8 × 0,602u4 + u8 + s4 + s8 - u1 - u2 - s1 - s2 Pour 3 niveaux: (d) log. A = u1 + u2 + u4 - s1 - s2 - s4 × 0,401u4 + s4 - u1 - s1 ou (d′) log. A = u2 + u4 + u8 - s2 - s4 - s8 × 0,401u8 + s8 - u2 - s2 Activité de l'extrait de l'échantillon = activité de l'étalon correspondant × A:(U8 = S8 × A)Si l'activité relative se trouve en dehors de la gamme des valeurs comprises entre 0,5 et 2,0, répéter la détermination en procédant à des ajustements appropriés des concentrations de l'extrait ou, éventuellement, des solutions étalons. Lorsque cette activité ne peut être ramenée dans la gamme des valeurs requises, le résultat doit être considéré comme approximatif et cette indication doit être notée sur le bulletin d'analyse.Lorsque les droites sont considérées comme n'étant pas parallèles, répéter la détermination. Si le parallélisme n'est toujours pas atteint, la détermination doit être considérée comme non satisfaisante.Exprimer le résultat en milligrammes de bacitracine-zinc par kilogramme d'aliment. 9.RÉPÉTABILITÉ La différence entre les résultats de deux déterminations parallèles effectuées sur le même échantillon par le même analyste ne doit pas dépasser:2 mg/kg, en valeur absolue, pour les teneurs en bacitracine-zinc inférieures à 10 mg/kg,20 % du résultat le plus élevé pour les teneurs de 10 à 25 mg/kg,5 mg/kg, en valeur absolue, pour les teneurs de 25 à 50 mg/kg,10 % du résultat le plus élevé pour les teneurs supérieures à 50 mg/kg. 2.DOSAGE DU FLAVOPHOSPHOLIPOL PAR DIFFUSION SUR GÉLOSE 1.OBJET ET DOMAINE D'APPLICATION La méthode permet de doser le flavophospholipol dans les aliments, les concentrats et les prémélanges. La limite inférieure du dosage est de 1 mg/kg (1 ppm). 2.PRINCIPE L'échantillon est soumis à une extraction par du méthanol dilué sous chauffage à reflux. L'extrait est centrifugé, purifié si nécessaire sur résines échangeuses d'ions et dilué. Son activité antibiotique est déterminée par mesure de la diffusion du flavophospholipol dans un milieu gélosé, ensemencé avec Staphylococcus aureus. La diffusion se révèle par la formation de zones d'inhibition du micro-organisme. Le diamètre de ces zones est considéré comme étant directement proportionnel au logarithme de la concentration en antibiotique pour la gamme des concentrations utilisées. 3.MICRO-ORGANISME: STAPHYLOCOCCUS AUREUS ATCC 6538 P 3.1.Entretien de la souche Ensemencer le milieu de culture (4.1), en tubes inclinés, par Staphylococcus aureus. Incuber 24 heures à 37 °C, conserver en réfrigérateur à 4 °C environ et renouveler l'ensemencement tous les mois. 3.2.Préparation de la suspension bactérienneD'autres méthodes peuvent être utilisées dans la mesure où il est prouvé qu'elles produisent une suspension bactérienne analogue. Prélever deux tubes contenant la culture-mère (3.1) et renouveler l'ensemencement toutes les semaines. Incuber 24 heures à 37 °C et conserver en réfrigérateur à 4 °C environ.24 heures avant le dosage, ensemencer à l'aide de ces cultures deux à quatre tubes inclinés contenant le milieu de culture (4.1).Incuber 16 à 18 heures à 37 °C. Mettre ensuite les germes en suspension dans la solution de chlorure de sodium (4.3). La transmission lumineuse de la suspension, mesurée à 578 nm sous une épaisseur de 1 cm par comparaison avec la solution de chlorure de sodium, doit être de 40 % environ. 4.MILIEUX DE CULTURE ET RÉACTIFS 4.1.Milieu d'entretien de la soucheTout milieu de culture commercial de composition analogue et donnant les mêmes résultats peut être utilisé, par exemple Oxoid Antibiotic Medium (CM 327) additionné de gélose Oxoid no 3 (L 13).
Peptone de viande 6,0 g
Tryptone 4,0 g
Extrait de levure 3,0 g
Extrait de viande 1,5 g
Glucose 1,0 g
Gélose 15,0 g
Eau 1000 ml
pH 6,5 (après stérilisation)
4.2.Milieu de base du dosage 4.2.1.Couche inférieureTout milieu de culture commercial de composition analogue et donnant les mêmes résultats peut être utilisé, par exemple Oxoid Antibiotic Medium 2 (CM 335) additionné de gélose Oxoid no 3 (L 13).
Peptone de viande 6,0 g
Extrait de levure 3,0 g
Extrait de viande 1,5 g
Gélose 10,0 g
Eau 1000 ml
pH 6,5 (après stérilisation)
4.2.2.Couche à ensemencer Milieu (4.1) additionné de 2 g d'émulsion antimousse de siliconePar exemple SE 2 de Wacker Chemie GmbH, Munich.. 4.3. Solution à 0,4 % (p/v) de chlorure de sodium: dissoudre dans l'eau 4 g de chlorure de sodium p.a., diluer à 1000 ml et stériliser. 4.4. Méthanol pur. 4.5. Méthanol à 50 % (v/v): diluer 500 ml de méthanol (4.4) par 500 ml d'eau. 4.6. Méthanol à 80 % (v/v): diluer 800 ml de méthanol (4.4) par 200 ml d'eau. 4.7. Tris(hydroxyméthyl)aminométhane p.a. 4.8. Solution méthanolique à 1,5 % (p/v) de chlorure de potassium: dissoudre 1,5 g de chlorure de potassium p.a. dans 20 ml d'eau, compléter à 100 ml par du méthanol (4.4). 4.9. Échangeur de cations: Dowex 50 WX8, 20—50 mesh, forme Na (cat. Serva no 41600) ou équivalent. 4.10. Échangeur d'anions: Dowex 1X2, 50—100 mesh, forme Cl (cat. Serva no 41010) ou équivalent. Avant l'emploi, maintenir le produit durant 12 à 14 heures dans le méthanol à 80 % (4.6). 4.11. Laine de verre. 4.12. Papier indicateur de pH (pH 6,6—8,1). 4.13. Acide ascorbique. 4.14. Substance étalon: flavophospholipol d'activité connue. 5.APPAREILLAGE 5.1. Tube pour chromatographie, en verre, diamètre intérieur: 9 mm, longueur: 150 à 200 mm, muni d'un robinet à la partie effilée de l'extrémité inférieure et d'un rodage normalisé (pour branchement de l'entonnoir 5.2) à l'extrémité supérieure. 5.2. Entonnoir avec réservoir de 250 ml, à robinet et rodage normalisé. 5.3. Fiole conique de 250 ml, à rodage normalisé. 5.4. Réfrigérant à reflux, à rodage normalisé. 6.SOLUTIONS ÉTALONS Dissoudre une quantité exactement pesée de substance étalon (4.14) dans du méthanol à 50 % (4.5) et diluer pour obtenir une solution mère de flavophospholipol à 100 μg/ml. Conservée en flacon bouché à 4 °C, cette solution est stable durant deux mois.Préparer à partir de cette solution et par dilutions successives à l'aide de méthanol à 50 % (4.5) les solutions suivantes:
S8 0,2 μ g/ml
S4 0,1 μ g/ml
S2 0,05 μ g/ml
S1 0,025 μ g/ml
 7.PRÉPARATION DE L'EXTRAIT 7.1.Extraction 7.1.1.Concentrats, prémélanges et aliments minéraux Peser une quantité d'échantillon de 2 à 5 g et y ajouter 150 mg environ d'acide ascorbique (4.13). Mélanger à 150 mg de méthanol à 50 % (4.5) dans une fiole (5.3) et ajuster le pH à 8,1—8,2 à l'aide de 400 mg environ de tris(hydroxyméthyl)aminométhane (4.7). Contrôler le pH au moyen du papier indicateur (4.12). Laisser macérer 15 minutes, ajuster à nouveau le pH à 8,1—8,2 à l'aide de tris(hydroxyméthyl)aminométhane (4.7) et faire ensuite bouillir durant 10 minutes sous réfrigérant à reflux (5.4) en remuant constamment. Laisser refroidir, puis centrifuger et décanter l'extrait. 7.1.2Autres aliments Peser une quantité d'échantillon de 5 à 30 g contenant au moins 30 μg de flavophospholipol. Mélanger à 150 ml de méthanol à 50 % (4.5) dans une fiole (5.3) et ajuster le pH à 8,1—8,2 à l'aide de 400 mg environ de tris(hydroxyméthyl)aminométhane (4.7). Contrôler le pH au moyen du papier indicateur (4.12). Laisser macérer 15 minutes, ajuster à nouveau le pH à 8,1—8,2 à l'aide de tris(hydroxyméthyl)aminométhane (4.7) et faire ensuite bouillir durant 10 minutes sous réfrigérant à reflux (5.4) en remuant constamment. Laisser refroidir, puis centrifuger et décanter l'extrait. 7.2Purification (cette modalité peut être omise pour les concentrats, les prémélanges et les aliments minéraux) Mélanger 110 ml de l'extrait à 11 g d'échangeur de cations (4.9), faire bouillir durant une minute sous réfrigérant à reflux (5.4) en remuant constamment. Séparer l'échangeur de cations par centrifugation ou filtration. Mélanger 100 ml de l'extrait à 150 ml de méthanol (4.4) et laisser reposer la solution 12 à 15 heures à 4 °C. Éliminer la matière floculente par filtration à froid.Munir l'extrémité inférieure d'un tube (5.1) d'un tampon de laine de verre (4.11), verser dans le tube 5 ml d'échangeur d'anions (4.10) et laver la colonne par 100 ml de méthanol à 80 % (4.6). Transvaser ensuite dans la colonne à l'aide de l'entonnoir (5.2) un volume de filtrat de 100 ml au moins supposé contenir 16 μg de flavophospholipol (200 ml pour un échantillon de 30 g d'aliment à 1 ppm). Si nécessaire, diluer le filtrat avant de le transvaser dans la colonne par du méthanol à 80 % (4.6) pour obtenir une concentration présumée en flavophospholipol de 16 μg par 100 ml. Régler le débit d'écoulement du liquide à 2 ml environ par minute. Éliminer la totalité du filtrat. Laver ensuite la colonne à l'aide de 50 ml de méthanol à 80 % (4.6) et éliminer le filtrat.Éluer le flavophospholipol par la solution méthanolique de chlorure de potassium (4.8) en maintenant le débit d'écoulement à 2 ml environ par minute. Recueillir 50 ml d'éluat dans une fiole graduée, ajouter 30 ml d'eau et homogénéiser. Cette solution devrait avoir une teneur en flavophospholipol de 0,2 μg/ml (= U8). 7.3.Solutions de l'extrait Si nécessaire (notamment dans les cas où la purification a été omise), diluer l'extrait obtenu en 7.1.1 par du méthanol à 50 % (4.5) pour obtenir une concentration présumée en flavophospholipol de 0,2 μg/ml (= U8).Préparer à partir de la solution U8 et par dilutions successives (1 + 1) à l'aide de méthanol à 50 % (4.5) les solutions U4 (concentration présumée: 0,1 μg/ml), U2 (concentration présumée: 0,05 μg/ml) et U1 (concentration présumée: 0,025 μg/ml). 8.MODALITÉS DU DOSAGE 8.1.Inoculation du milieu de culture Ensemencer à 50 °C environ le milieu de base du dosage (4.2.2) par la suspension bactérienne (3.2). Par des essais préliminaires sur plaques avec le milieu (4.2.2), déterminer la quantité de suspension bactérienne permettant d'obtenir pour les différentes concentrations en flavophospholipol des zones d'inhibition aussi étendues que possible et qui soient encore nettes (30 ml environ par litre). 8.2.Préparation des boîtes La diffusion sur gélose s'effectue dans des boîtes avec les quatre concentrations de la solution étalon (S8, S4, S2, S1) et les quatre concentrations de l'extrait (U8, U4, U2, U1). Chaque boîte doitnécessairement recevoir les quatre concentrations de l'étalon et de l'extrait. À cet effet, choisir la dimension des boîtes de telle sorte qu'on puisse creuser dans le milieu gélosé au moins huit cavités de 10 à 13 mm de diamètre, dont les centres ne sont pas distants de moins de 30 mm. On peut utiliser comme boîtes des plaques de verre planes, surmontées d'un anneau d'aluminium ou de matière plastique de 200 mm de diamètre et 20 mm de hauteur.Introduire dans les boîtes une quantité du milieu (4.2.1) permettant d'obtenir une couche de 1,5 mm environ d'épaisseur (45 ml pour une boîte de 200 mm de diamètre). Laisser solidifier et ajouter une quantité du milieu (4.2.2), ensemencé comme indiqué au point 8.1, permettant d'obtenir une couche de 1 mm d'épaisseur (30 ml pour une boîte de 200 mm de diamètre). Laisser solidifier, creuser les cavités et y déposer des volumes exactement mesurés des solutions de l'étalon et de l'extrait (0,10 à 0,15 ml par cavité, selon le diamètre).Faire au moins quatre répétitions de chaque concentration de façon que chaque détermination fasse l'objet d'une évaluation de 32 zones d'inhibition. 8.3.Incubation Incuber les boîtes 16 à 18 heures à 28—30 °C. 9.ÉVALUATION Mesurer le diamètre des zones d'inhibition à 0,1 mm près. Pour chaque concentration, enregistrer les mesures moyennes sur papier semi-logarithmique en portant le logarithme des concentrations en regard des diamètres des zones d'inhibition. Tracer les droites les mieux ajustées pour la solution étalon et pour l'extrait en procédant, par exemple, comme suit.Déterminer le point le plus approprié du niveau le plus bas de la solution étalon (SL) à l'aide de la formule: (a) SL = 7 S1 + 4 S2 + S4 - 2 S810 Déterminer le point le plus approprié du niveau le plus élevé de la solution étalon (SH) à l'aide de la formule: (b) SH = 7 S8 + 4 S4 + S2 - 2 S110 Déterminer de la même façon les points les plus appropriés de l'extrait pour le niveau le plus bas (UL) et le niveau le plus élevé (UH) en remplaçant S1, S2, S4 et S8 dans les formules susmentionnées par U1, U2, U4 et U8.Inscrire les valeurs SL et SH sur le même graphique. En joignant les deux points, on obtient la droite la mieux ajustée pour la solution étalon. En procédant de la même façon pour UL et UH, on obtient la droite la mieux ajustée pour l'extrait.En l'absence de toute interférence, les droites devraient être parallèles. En pratique, on les considère comme étant parallèles lorsque (SH—SL) et UH—UL) ne diffèrent pas de plus de 10 % de leur moyenne.Si les droites ne sont par parallèles, on peut éliminer soit U1 et S1 soit U8 et S8. Les valeurs SL, SH, UL et UH permettant d'obtenir les droites les mieux ajustées sont alors calculées à l'aide des formules suivantes: (a′) ou 5 S2 + 2 S4 - S86 (b′) ou 5 S8 + 2 S4 - S26 et de formules analogues pour UL et UH. L'utilisation de cette alternative doit également faire l'objet d'une vérification quant au parallélisme des droites, comme indiqué plus haut. L'obtention d'un résultat provenant de trois niveaux doit être mentionnée sur le bulletin d'analyse.Lorsque les droites sont considérées comme étant parallèles, calculer le logarithme de l'activité relative (log. A) par l'une des formules ci-après.Pour 4 niveaux(c) log. A = U1 + U2 + U4 + U8 - S1 - S2 - S4 - S8 × 0,602U4 + U8 + S4 + S8 - U1 - U2 - S1 - S2 Pour 3 niveaux(d) log. A = U1 + U2 + U4 - S1 - S2 - S4 × 0,401U4 + S4 - U1 - S1 log. A = U2 + U4 + U8 - S2 - S4 - S8 × 0,401U8 + S8 - U2 - S2 Activité réelle = activité présumée × activité relative.Lorsque les droites sont considérées comme n'étant pas parallèles, répéter la détermination. Si celle-ci ne permet toujours par d'atteindre le parallélisme, calculer le logarithme de l'activité relative (log. A) à l'aide de la formule (c). Le résultat obtenu devra toutefois être considéré comme étant une approximation et il y aura lieu d'en faire mention sur le bulletin d'analyse. 10.RÉPÉTABILITÉ La différence entre les résultats de deux déterminations effectuées sur le même échantillon par le même analyste ne devrait pas dépasser:0,5 mg/kg, en valeur absolue, pour les teneurs en flavophospholipol de 1 à 2 mg/kg,25 % du résultat le plus élevé pour les teneurs supérieures à 2 mg/kg et jusqu'à 10 mg/kg,20 % du résultat le plus élevé pour les teneurs supérieures à 10 mg/kg et jusqu'à 25 mg/kg,5 mg/kg, en valeur absolue, pour les teneurs supérieures à 25 mg/kg et jusqu'à 50 mg/kg,10 % du résultat le plus élevé pour les teneurs supérieures à 50 mg/kg. 3.DOSAGE DES OLIGO-ÉLÉMENTS FER, CUIVRE, MANGANÈSE ET ZINC 1.OBJET ET DOMAINE D'APPLICATION La méthode permet de doser les oligo-éléments fer, cuivre, manganèse et zinc dans les aliments des animaux. Les limites inférieures de détermination sont les suivantes:
fer (Fe) 20 mg/kg
cuivre (Cu) 10 mg/kg
manganèse (Mn) 20 mg/kg
zinc (Zn) 20 mg/kg
 2.PRINCIPE L'échantillon est mis en solution dans l'acide chlorhydrique après destruction éventuelle des matières organiques. Les éléments fer, cuivre, manganèse et zinc sont déterminés, après dilution appropriée, par spectrométrie d'absorption atomique. 3.RÉACTIFS Remarques préliminaires L'eau utilisée pour la préparation des réactifs et des solutions requises au cours de l'analyse doit être exempte des cations à déterminer. Elle est obtenue soit par double distillation de l'eau dans un appareil en borosilicate ou en quartz, soit par double permutation sur résine échangeuse d'ions.Les réactifs doivent être au moins de qualité "pour analyse" (p.a.). L'absence de l'élément à déterminer doit être contrôlée par un essai à blanc. Si nécessaire, les réactifs seront soumis à une purification plus poussée.Les solutions étalons décrites ci-après peuvent être remplacées par des solutions étalons commerciales à condition que celles-ci soient garanties et contrôlées avant l'emploi. 3.1. Acide chlorhydrique p.a., d: 1,19. 3.2. Acide chlorhydrique p.a., 6 N. 3.3. Acide chlorhydrique p.a., 0,5 N. 3.4. Acide fluorhydrique à 38 — 40 % (v/v), ayant une teneur en fer inférieure à 1 mg/l et dont le résidu d'évaporation est inférieur à 10 mg (exprimés en sulfates)/l. 3.5. Acide sulfurique p.a., d: 1,84. 3.6. Eau oxygénée p.a., à 100 vol. environ d'oxygène (30 % en poids). 3.7. Solution étalon de fer (1000 μg Fe/ml): dissoudre 1 g de fer en fil p.a. dans 200 ml d'acide chlorhydrique 6 N (3.2), ajouter 16 ml d'eau oxygénée (3.6.) et compléter à 1 l par de l'eau. 3.7.1. Solution étalon de travail (100 μg Fe/ml): diluer la solution étalon (3.7) à 1 + 9 par de l'eau. 3.8. Solution étalon de cuivre (100 μg Cu/ml): dissoudre 1 g de cuivre en poudre p.a. dans 25 ml d'acide chlorhydrique 6 N (3.2), ajouter 5 ml d'eau oxygénée (3.6) et compléter à 1 l par de l'eau. 3.8.1. Solution étalon de travail (10 μg Cu/ml): diluer la solution étalon (3.8) à 1 + 9 par de l'eau; diluer ensuite la solution obtenue à 1 + 9 par de l'eau. 3.9. Solution étalon de manganèse (1000 μg Mn/ml): dissoudre 1 g de manganèse en poudre p.a. dans 25 ml d'acide chlorhydrique 6 N (3.2) et compléter à 1 l par de l'eau. 3.9.1. Solution étalon de travail (10 μg Mn/ml): diluer la solution étalon (3.9) à 1 + 9 par de l'eau; diluer ensuite la solution obtenue à 1 + 9 par de l'eau. 3.10. Solution étalon de zinc (1000 μg Zn/ml): dissoudre 1 g de zinc en ruban ou en plaque p.a. dans 25 ml d'acide chlorhydrique 6 N (3.2) et compléter à 1 l par de l'eau. 3.10.1. Solution étalon de travail (10 μg Zn/ml): diluer la solution étalon (3.10) à 1 + 9 par de l'eau; diluer ensuite la solution obtenue à 1 + 9 par de l'eau. 3.11. Solution de chlorure de lanthane: dissoudre 12 g d'oxyde de lanthane dans 150 ml d'eau, ajouter 100 ml d'acide chlorhydrique 6 N (3.2) et compléter à 1 l par de l'eau. 4.APPAREILLAGE 4.1. Four à moufle, à température réglable et contrôlée. 4.2. Verrerie en borosilicate, résistante. Il est recommandé d'utiliser un matériel servant exclusivement aux dosages des oligo-éléments. 4.3. Capsules de platine et, éventuellement, de quartz. 4.4. Spectrophotomètre d'absorption atomique, répondant aux exigences de la méthode en ce qui concerne la sensibilité et la précision dans la gamme des mesures utiles. 5.MODE OPÉRATOIRE 5.1.Échantillon contenant des composés organiques 5.1.1.Incinération et préparation de la solution à analyserLes fourrages verts (frais ou déshydratés) sont susceptibles de contenir de grandes quantités de silice végétale pouvant retenir des oligo-éléments et qui doivent être éliminés. Les échantillons de ces aliments doivent être soumis au traitement suivant. Effectuer l'opération 5.1.1 i) jusqu'au stade de la filtration. Laver le papier filtre contenant le résidu insoluble à deux reprises avec de l'eau bouillante et le placer dans une capsule de platine (4.3). Incinérer dans le four à moufle (4.1) à une température inférieure à 550 °C jusqu'à ce que toute la matière charbonneuse ait complètement disparu. Laisser refroidir, ajouter quelques gouttes d'eau puis 10 à 15 ml d'acide fluorhydrique (3.4) et évaporer à sec à 150 °C environ. Si le résidu contient encore de la silice, dissoudre celle-ci dans quelques ml d'acide fluorhydrique (3.4) et évaporer à sec. Ajouter 5 gouttes d'acide sulfurique (3.5) et chauffer jusqu'à disparition des fumées blanches. Ajouter 5 ml d'acide chlorhydrique 6 N (3.2) et 30 ml environ d'eau, chauffer, filtrer la solution dans un ballon jaugé de 250 ml et compléter au volume par de l'eau (la concentration en HCl est de 0,5 N environ). Poursuivre le procédé à partir du point 5.1.3. i)Placer 5 à 10 g de l'échantillon, pesés à 0,2 mg près, dans une capsule de quartz ou de platine (4.3) [voir note b)] sécher à l'étuve à 105 °C et introduire la capsule dans le four à moufle (4.1) froid. Fermer le four [voir note c)] et élever progressivement sa température pour atteindre 450 à 475 °C en 90 minutes environ. Maintenir cette température durant 4 à 16 h (par exemple, durant la nuit) de façon à éliminer la matière charbonneuse, ouvrir ensuite le four et laisser refroidir [voir note d)]. Humecter les cendres avec de l'eau, puis les transvaser dans un becher de 250 ml. Rincer la capsule à l'aide de 5 ml d'acide chlorhydrique (3.1) et transvaser lentement et avec précaution la solution de rinçage dans le becher (une réaction violente peut se produire par formationde CO2). Ajouter ensuite goutte à goutte de l'acide chlorhydrique (3.1), tout en remuant le contenu du becher, jusqu'à cessation de l'effervescence. Évaporer à sec en remuant périodiquement à l'aide d'une tige de verre.Ajouter au résidu 15 ml d'acide chlorhydrique 6 N (3.2) et ensuite 120 ml environ d'eau. Mélanger à l'aide d'une tige de verre, laisser celle-ci dans le becher et recouvrir d'un verre de montre. Porter le liquide à ébullition douce et maintenir l'ébullition jusqu'à ce que les cendres ne se dissolvent apparemment plus. Filtrer sur un papier filtre sans cendres et recueillir le filtrat dans un ballon jaugé de 250 ml. Laver le becher et le filtre avec 5 ml d'acide chlorhydrique 6 N (3.2) chaud et à deux reprises avec de l'eau bouillante. Compléter au volume par de l'eau (la concentration en HCl est de 0,5 N environ). ii)Si le résidu se trouvant dans le filtre apparaît noir (charbonneux), le placer à nouveau dans le four et incinérer à 450 — 475 °C. Cette incinération, qui requiert seulement quelques heures (3 à 5 heures environ), est complétée lorsque les cendres apparaissent blanches ou presque blanches. Dissoudre le résidu dans 2 ml environ d'acide chlorhydrique (3.1), évaporer à sec et ajouter 5 ml d'acide chlorhydrique 6 N (3.2). Chauffer, filtrer la solution dans le ballon jaugé et compléter au volume avec de l'eau (la concentration en HCl est de 0,5 N environ). Notes: a)Lors du dosage des oligo-éléments, il y a lieu d'attirer l'attention sur les risques de contamination, notamment par le zinc, le cuivre et le fer. C'est pourquoi les instruments utilisés pour la préparation des échantillons doivent être exempts de ces métaux. Pour réduire les risques de contamination, il convient de travailler en atmosphère exempte de poussières avec un matériel rigoureusement propre et une verrerie soigneusement lavée. Le dosage du zinc est particulièrement sensible aux contaminations provenant notamment de la verrerie, des réactifs, de la poussière, etc. b)Calculer le poids de l'échantillon à incinérer en fonction de la teneur approximative de l'aliment en oligo-élément à doser et de la sensibilité du spectrophotomètre utilisé. Pour certains aliments pauvres en oligo-éléments, il peut être nécessaire de prélever un échantillon de 10 à 20 g et de limiter le volume de la solution finale à 100 ml. c)Incinérer dans un four fermé sans injection d'air ou d'oxygène. d)La température indiquée par le pyromètre ne doit pas dépasser 475 °C. 5.1.2.Détermination spectrophotométrique 5.1.2.1. Préparation des solutions d'étalonnagePréparer pour chaque oligo-élément à doser une gamme de solutions d'étalonnage à partir des solutions étalons de travail 3.7.1, 3.8.1, 3.9.1 et 3.10.1, de façon que chaque solution d'étalonnage ait une concentration en HCl de 0,5 N environ et, dans le cas du fer, du manganèse et du zinc, une concentration en chlorure de lanthane correspondant à 0,1 % de lanthane (p/v). Les concentrations choisies en oligo-éléments doivent se trouver dans la zone de sensibilité du spectrophotomètre utilisé. Les tableaux ci-après donnent, à titre d'exemple, des types de composition de solution d'étalonnage; selon le type et la sensibilité du spectrophotomètre utilisé, il peut être nécessaire de choisir d'autres concentrations.
Fer
μg Fe/ml 0 0,5 1 2 3 4 5
ml de solution étalon de travail (3.7.1)
(1 ml = 100 μg Fe) 0 0,5 1 2 3 4 5
+ ml HCl 6 N (3.2) 7 7 7 7 7 7 7
+ 10 ml de solution de chlorure de lanthane (3.11); compléter à 100 ml par de l'eau.
Cuivre
μg Cu/ml 0 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
ml de solution étalon de travail (3.8.1)
(1 ml = 10 μg Cu) 0 1 2 4 6 8 10
+ ml HCl 6 N (3.2) 8 8 8 8 8 8 8
Compléter à 100 ml par de l'eau.
Manganèse
μg Mn/ml 0 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
ml de solution étalon de travail (3.9.1)
(1 ml = 10 μg Mn) 0 1 2 4 6 8 10
+ ml HCl 6 N (3.2) 7 7 7 7 7 7 7
+ 10 ml de solution de chlorure de lanthane (3.11); compléter à 100 ml par de l'eau.
Zinc
μg Zn/ml 0 0,05 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8
ml de solution étalon de travail (3.10.1)
(1 ml = 10 μg Zn) 0 0,5 1 2 4 6 8
+ ml HCl 6 N (3.2) 7 7 7 7 7 7 7
+ 10 ml de solution de chlorure de lanthane (3.11); compléter à 100 ml par de l'eau.
 5.1.2.2. Préparation de la solution à analyserPour le dosage du cuivre, la solution préparée selon 5.1.1 peut, en règle générale, être utilisée directement. S'il est nécessaire d'amener sa concentration dans la gamme des concentrations des solutions d'étalonnage, une partie aliquote peut être introduite à la pipette dans un ballon jaugé de 100 ml et complétée au volume par de l'acide chlorhydrique 0,5 N (3.3).Pour le dosage du fer, du manganèse et du zinc, introduire à la pipette une portion aliquote de la solution préparée selon 5.1.1 dans un ballon jaugé de 100 ml; ajouter 10 ml de solution de chlorure de lanthane (3.11) et compléter au volume par de l'acide chlorhydrique 0,5 N (3.3) (voir aussi point 8 "Observation"). 5.1.2.3. Essai à blancEffectuer un essai à blanc comportant toutes les étapes prescrites du mode opératoire, en excluant la présence de l'échantillon.La solution d'étalonnage "O" ne doit pas être utilisée comme "blanc". 5.1.2.4. Mesure de l'absorption atomiqueMesurer l'absorption des solutions d'étalonnage et de la solution à analyser, en utilisant une flamme oxydante air-acétylène, aux longueurs d'onde ci-après:
Fe 248,3 nm
Cu 324,8 nm
Mn 279,5 nm
Zn 213,8 nm.
Effectuer chaque mesure quatre fois. 5.2.Composés minéraux En l'absence de matière organique, l'incinération préalable est inutile. Appliquer le mode opératoire à partir du deuxième paragraphe du point 5.5.1 i). L'évaporation en présence d'acide fluorhydrique peut être omise. 6.CALCUL DES RÉSULTATS Calculer la concentration en oligo-éléments dans la solution à analyser à l'aide d'une courbe d'étalonnage et exprimer le résultat en mg d'oligo-élément par kg d'échantillon (ppm). 7.RÉPÉTABILITÉ La différence entre les résultats de deux déterminations parallèles effectuées sur le même échantillon par le même analyste ne devrait pas dépasser: 5 mg/kg, en valeur absolue, pour les teneurs en oligo-éléments concernés allant jusqu'à 50 mg/kg, 10 % du résultat le plus élevé pour les teneurs supérieures à 50 et jusqu'à 100 mg/kg, 10 mg/kg, en valeur absolue, pour les teneurs supérieures à 100 et jusqu'à 200 mg/kg, 5 % du résultat le plus élevé pour les teneurs supérieures à 200 mg/kg. 8.OBSERVATION La présence de grandes quantités de phosphates peut interférer dans le dosage du fer, du manganèse et du zinc. Cette interférence doit être corrigée par addition de solution de chlorure de lanthane (3.11). Cependant, si l'échantillon a un rapport pondéral , l'addition de solution de chlorure de lanthane (3.11) à la solution à analyser et aux solutions d'étalonnage peut être omise.