RÈGLEMENT (CEE) Nº 72/77 DE LA COMMISSION du 13 janvier 1977 modifiant le règlement (CEE) nº 1470/68 relatif à la prise et à la réduction des échantillons ainsi qu'à la détermination de la teneur en huile, en impuretés et en humidité des graines oléagineuses

LA COMMISSION DES COMMUNAUTÉS EUROPÉENNES,

vu le traité instituant la Communauté économique européenne,

vu le règlement nº 136/66/CEE du Conseil, du 22 septembre 1966, portant établissement d'une organisation commune des marchés dans le secteur des matières grasses (1), modifié en dernier lieu par le règlement (CEE) nº 1707/73 (2), et notamment son article 26 paragraphe 3,

considérant que, pour pouvoir déterminer avec précision pour les graines de colza et de navette leur teneur en acide érucique, il convient de prévoir une méthode appropriée ; que, à cette fin, il y a lieu de modifier le règlement (CEE) nº 1470/68 de la Commission, du 23 septembre 1968, relatif à la prise et à la réduction des échantillons ainsi qu'à la détermination de la teneur en huile, en impuretés et en humidité des graines oléagineuses (3), modifié en dernier lieu par le règlement (CEE) nº 3025/75 (4);

considérant que les mesures prévues au présent règlement sont conformes à l'avis du comité de gestion des matières grasses,

A ARRÊTÉ LE PRÉSENT RÈGLEMENT:

Article premier

Au règlement (CEE) nº 1470/68 est ajouté l'article 2ter suivant:

«La détermination de la teneur en acide érucique visée à l'article 4 du règlement nº 282/67/CEE est effectuée selon la méthode définie à l'annexe VI du présent règlement.

Sont considérées comme ayant la teneur maximale en acide érucique visée à l'article 3 paragraphe 2 premier tiret du règlement nº 282/67/CEE les graines de colza et de navette dont l'huile qui en aura été extraite conformément à la méthode figurant à l'annexe VI titre I contient au maximum 15,0 % d'acide érucique C 22 calculé selon la méthode figurant à l'annexe VI titres II et III.»

Article 2

Le règlement (CEE) nº 1470/68 est complété par l'annexe VI dont le texte figure à l'annexe du présent règlement.

Article 3

Le présent règlement entre en vigueur le troisième jour suivant celui de sa publication au Journal officiel des Communautés européennes.

Le présent règlement est obligatoire dans tous ses éléments et directement applicable dans tout État membre.

Fait à Bruxelles, le 13 janvier 1977.

Par la Commission

Finn GUNDELACH

Vice-président (1)JO nº 172 du 30.9.1966, p. 3025/66. (2)JO nº L 175 du 29.6.1973, p. 5. (3)JO nº L 239 du 28.9.1968, p. 2. (4)JO nº L 300 du 20.11.1975, p. 5.

ANNEXE VI MÉTHODE D'ANALYSE COMMUNAUTAIRE À UTILISER POUR LA DÉTERMINATION DE LA TENEUR EN ACIDE ÉRUCIQUE, EN CE QUI CONCERNE LES GRAINES PRISES EN CHARGE PAR LES ORGANISMES D'INTERVENTION

I. Préparations des échantillons

II. Préparation des esters méthyliques d'acides gras

III. Chromatographie en phase gazeuse des esters méthyliques d'acides gras

I. PRÉPARATIONS DES ÉCHANTILLONS

1. La prise des échantillons de graines, la réduction des échantillons pour laboratoire en échantillons pour analyse, la détermination de la teneur en huile sur produit tel quel sont effectuées selon les méthodes définies respectivement aux annexes I, II et V du règlement (CEE) nº 1470/68.

2. Préparation de l'échantillon d'huile extraite des graines ayant fait l'objet de l'échantillonnage. 2.1. L'échantillon est fluide et parfaitement limpide:

avant d'effectuer les prises d'essais, agiter l'échantillon par mesure de précaution.

2.2. L'échantillon est fluide, mais trouble ou renfermant un dépôt:

placer l'échantillon dans une étuve à 50 ºC. Quand l'échantillon a atteint cette température, l'agiter vigoureusement ; laisser décanter. Filtrer sur papier dans l'étuve en maintenant la température à 30 ºC.

2.3. L'échantillon est concret:

le placer dans l'étuve maintenue à une température de 10 ºC supérieure à celle de la zone de fusion présumée. Opérer comme aux points 2.1 (si l'échantillon fondu est limpide) et 2.2 (si l'échantillon fondu est trouble ou renfermant un dépôt).

II. PRÉPARATION DES ESTERS MÉTHYLIQUES D'ACIDES GRAS

1. PRÉAMBULE

Les présentes méthodes ont pour objet la transformation des corps gras d'origines animale et végétale, ainsi que celle des acides gras de toute origine, en esters méthyliques d'acides gras.

Les esters méthyliques ainsi obtenus peuvent être utilisés dans diverses méthodes exigeant une telle transformation chromatographie en phase gazeuse, chromatographie en couche mince, spectro-photométrie infrarouge, etc

2. DOMAINE D'APPLICATION

Les méthodes décrites s'appliquent aux corps gras d'origines animale et végétale. Les méthodes décrites au point 3 sont applicables à la préparation des esters méthyliques d'acides gras ayant 6 atomes de carbone et plus. En présence d'acides gras C6 et C8, et dans le cas de la préparation d'esters destinés à la chromatographie en phase gazeuse, il y a lieu de ne pas chasser le solvant de la solution d'esters méthyliques.

La méthode générale 3.1 peut fournir des résultats erronés dans le cas de présence: - des composés à fonctions oxygénées secondaires (hydroxy, hydroperoxy, céto, époxy),

- des composés à fonctions cyclopropanique et cyclopropénique,

- des composés polyinsaturés conjugués et des composés acétyléniques,

- des cires,

et il est alors préférable d'utiliser une des méthodes décrites au point 3.2. Toutefois, les corps gras contenant de telles fonctions en très faibles proportions (huile de coton par exemple) peuvent être analysés selon la méthode 3.1.

Les phospholipides peuvent être analysés après saponification et estérification des acides gras.

L'insaponifiable n'est pas éliminé et, s'il est présent en quantité notable, il peut interférer dans les analyses ultérieures (note 1).

3. MÉTHODES DE PRÉPARATION DES ESTERS MÉTHYLIQUES D'ACIDES GRAS AYANT 6 ATOMES DE CARBONE ET PLUS

Au point 3.1, il est donné une méthode générale de préparation des esters méthyliques utilisant le trifluorure de bore et devant être adoptée préférentiellement. Lorsqu'il n'est pas possible d'utiliser cette méthode, des méthodes de remplacement sont décrites au point 3.2. 3.1. Méthode générale utilisant le trifluorure de bore 3.1.1. Principe

Saponification des glycérides, puis libération et estérification des acides gras en présence de trifluorure de bore

3.1.2. Matériel - ballons de 50 à 100 ml à col rodé,

- réfrigérant droit, de 20 à 30 cm de longueur utile, avec rodage adaptable sur le ballon,

- régularisateur d'ébullition, exempt de graisse,

- tubulure pour barbotage d'azote,

- pipette graduée, d'une capacité au moins égale à 10 ml, et poire pour pipette ou pipette automatique.

- tubes à essais avec bouchon rodé,

- ampoules à décantation de 250 ml.

3.1.3. Réactifs - solution méthanolique d'hydroxyde de sodium environ 0,5 N:

dissoudre 2 g d'hydroxyde de sodium dans 100 ml de méthanol ne contenant pas plus de 0,5 % (m/m) d'eau. Lorsque la solution doit être utilisée pendant une période de temps assez longue, un peu de carbonate de sodium se forme (précipité blanc) ; celui-ci n'a aucune influence sur la préparation des esters méthyliques,

- solution méthanolique de trifluorure de bore, de teneur comprise entre 12 et 15 % (m/m). (Des solutions à 14 et 50 % existent dans le commerce.) (note 2).

Avertissement : Le trifluorure de bore est un composé toxique. C'est pourquoi il n'est pas recommandé de préparer soi-même la solution à partir de trifluorure de bore et de méthanol (note 3),

- heptane, pour chromatographie (note 2, note 4),

- éther de pétrole redistillé (Eb 40-60 ºC), indice de brome inférieur à 1, exempt de résidu, ou hexane (note 2),

- sulfate de sodium anhydre,

- solution saturée de chlorure de sodium,

- rouge de méthyle en solution à 0,1 % (m/v) dans l'éthanol à 60 % (v/v),

- azote contenant moins de 5 mg d'oxygène par kg.

3.1.4. Mode opératoire

Les opérations suivantes seront de préférence effectuées sous une hotte par suite des propriétés toxiques du trifluorure de bore. Toute la verrerie sera lavée à l'eau immédiatement après emploi.

En présence d'huiles ou d'acides gras contenant des acides à plus de 2 doubles liaisons, il est recommande d'éliminer l'air contenu dans le méthanol et dans le ballon par un barbotage d'azote pendant quelques minutes.

Préparer l'échantillon conformément à «I. Préparations des échantillons».

Une pesée exacte n'est pas nécessaire. L'importance de la prise d'essai a seulement besoin d'être connue pour choisir la taille du ballon et les quantités de réactifs, selon le tableau suivant: >PIC FILE= "T0011218">

Dans le cas ou les esters méthyliques sont destinés à l'analyse par chromatographie en phase gazeuse, la prise d'essai sera de préférence d'environ 350 mg. Si elle est plus petite, il y a lieu de prendre des précautions pour que l'échantillon prélevé soit représentatif (note 5). 3.1.4.1. Pour les huiles et graisses

Introduire la prise d'essai préparée dans le ballon. Ajouter la quantité indiquée de la solution méthanolique d'hydroxyde de sodium et un régularisateur d'ébullition. Adapter le réfrigérant sur le ballon. Porter à l'ébullition à reflux jusqu'à disparition des gouttelettes de matière grasse (cette opération peut durer de cinq à dix minutes, mais, dans certains cas exceptionnels, peut dépasser dix minutes).

Dans le mélange à l'ébullition, par le haut du réfrigérant et en utilisant la pipette graduée avec la poire pour pipette ou la pipette automatique, ajouter la quantité indiquée de la solution méthanolique de trifluorure de bore. Continuer l'ébullition pendant deux minutes.

Ajouter au mélange bouillant 2 à 5 ml d'héptane (note 4) par le haut du réfrigérant (la quantité d'heptane est sans importance sur la réaction) et continuer l'ébullition pendant une minute.

Enlever la source de chauffage du ballon, puis le réfrigérant. Ajouter quelques ml de la solution saturée de chlorure de sodium et agiter doucement le ballon plusieurs fois par rotation.

Continuer à ajouter de la solution saturée de chlorure de sodium pour porter le niveau du liquide dans le col du ballon. Transférer environ 1 ml de la couche supérieure (solution heptanique) dans un tube à essais rodé et ajouter la quantité de sulfate de sodium anhydre nécessaire pour éliminer les traces d'eau. Dans le cas d'une prise d'essai de 350 mg, la solution obtenue contient environ 5 à 10 % d'esters méthyliques et peut être injectée directement dans la colonne de chromatographie en phase gazeuse. Dans les autres cas, diluer la solution heptanique pour obtenir une concentration de 5 à 10 % en esters méthyliques (note 6).

Pour obtenir la totalité des esters secs, transférer la solution saline et la phase heptanique dans une ampoule à décantation de 250 ml. Décanter. Extraire la solution saline avec 50 ml d'éther de pétrole (Eb 40-60 ºC) ou d'hexane.

Répéter une deuxième fois cette extraction. Réunir la phase heptanique et les deux extraits et les laver avec des portions de 20 ml d'eau jusqu'à disparition de l'acidité (indicateur : rouge de méthyle). Sécher avec du sulfate de sodium anyhdre et évaporer le solvant au bain-marie sous courant d'azote (note 6, note 7). Pour des prises d'essai inférieures à 500 mg, il est préférable de réduire proportionnellement les volumes de solvant et d'eau.

3.1.4.2. Pour les acides gras

Si l'échantillon est constitué uniquement d'acides gras, la saponification n'est pas effectuée.

Introduire la quantité voulue d'acides gras préparés dans le ballon. Ajouter la quantité prescrite de la solution méthanolique de trifluorure de bore. Porter à l'ébullition pendant deux minutes. Procéder ensuite comme indiqué au point 3.1.4.1 à partir de : «Ajouter au mélange bouillant ...»

3.2. Méthodes de remplacement n'utilisant pas le trifluorure de bore 3.2.1. Pour les corps gras neutres (IA 3.2.1.1. Principe

Méthanolyse des glycérides en milieu alcalin.

3.2.1.2. Matériel - agitateur permettant une agitation rapide et disposition de chauffage approprié (par exemple, agitateur magnétique chauffant),

- fiole conique ou ballon de 100 ml à col rodé,

- tubulure pour barbotage d'azote,

- réfrigérant s'adaptant sur la fiole conique ou le ballon,

- régularisateur d'ébullition, exempt de graisse,

- ampoules à décantation de 125 ml,

- fiole conique, à ouverture étroite, de 50 ml.

3.2.1.3. Réactifs - méthanol, ne contenant pas plus de 0,5 % (m/m) d'eau,

- solution méthanolique d'hydroxyde de potassium environ 1 N:

dissoudre 5,6 g d'hydroxyde de potassium dans 100 ml de méthanol ne contenant pas plus de 0,5 % (m/m) d'eau,

- heptane pour chromatographie (note 2, note 4),

- sulfate de sodium anhydre,

- azote contenant moins de 5 mg d'oxygène par kg.

3.2.1.4. Mode opératoire

En présence d'huiles contenant des acides à plus de 2 doubles liaisons, il est recommandé d'éliminer l'air contenu dans le méthanol et dans le ballon par un barbotage d'azote pendant quelques minutes.

Préparer l'échantillon conformément à «I. Préparations des échantillons».

Dans une fiole conique ou un ballon de 100 ml, introduire environ 4 g (note 5) de corps gras préparé. Ajouter environ 40 ml de méthanol, 0,5 ml de la solution d'hydroxyde de potassium et un régularisateur d'ébullition. Mettre sous réfrigérant à reflux, agiter et porter à ébullition. La solution doit devenir limpide. La réaction est généralement terminée au bout de cinq à dix minutes Dans le cas d'huiles du type «huile de ricin», la limpidité n'est pas le critère de réaction (note 8).

Refroidir sous courant d'eau et transvaser dans une ampoule à décantation de 125 ml. Rincer la fiole ou le ballon avec 20 ml d'heptane (note 4) et les verser dans l'ampoule.

Ajouter environ 40 ml d'eau, agiter et laisser décanter. Les esters se rassemblent dans la phase heptanique supérieure. Épuiser la phase aqueuse une seconde fois avec 20 ml d'heptane. Réunir les deux extraits et laver deux fois avec 20 ml d'eau. Après décantation, sécher sur sulfate de sodium anhydre la solution d'esters, filtrer sur coton et évaporer éventuellement jusqu'à 20 ml le solvant au bain d'eau bouillante avec barbotage d'azote dans une fiole conique de 50 ml (note 6, note 7).

3.2.2. Pour les corps gras acides (IA > 2) et les acides gras 3.2.2.1. Principe

Pour les corps gras acides, neutralisation des acides gras libres, méthanolyse alcaline des glycérides, puis estérification des acides gras en milieu acide.

Pour les acides gras, estérification en milieu acide.

3.2.2.2. Matériel - agitateur permettant une agitation rapide et dispositif de chauffage approprié (par exemple, agitateur magnétique chauffant),

- fiole conique ou ballon de 250 ml à col rodé,

- tubulure pour barbotage d'azote,

- réfrigérant s'adaptant sur la fiole conique ou le ballon,

- régularisateur d'ébullition, exempt de graisse,

- ampoules à décantation de 250 ml,

- fiole conique, à étroite ouverture, de 100 ml.

3.2.2.3. Réactifs - solution de méthylate de sodium obtenue en dissolvant 1 g de sodium dans 100 ml de méthanol ne contenant pas plus de 0,5 % (m/m) d'eau,

- solution méthanolique d'acide chlorhydrique anhydre environ 1 N [voir remarques 3.2.2.6 a) et b)].

- heptane pour chromatographie (note 2, note 4),

- sulfate de sodium anhydre,

- azote contenant moins de 5 mg d'oxygène par kg.

3.2.2.4. Mode opératoire pour les corps gras acides (IA > 2)

En présence d'huiles contenant des acides à plus de 2 doubles liaisons, il est recommandé d'éliminer l'air contenu dans le méthanol et dans le ballon par un barbotage d'azote pendant quelques minutes.

Préparer l'échantillon conformément à «I. Préparations des échantillons».

Dans une fiole conique ou un ballon de 250 ml, introduire environ 4 g (note 5) de corps gras préparé.

Ajouter 40 ml de la solution de méthylate de sodium [voir remarque 3.2.2.6 c)]. Mettre sous réfrigérant à reflux, agiter et porter à ébullition. La solution doit devenir limpide, ce qui se produit généralement au bout d'une dizaine de minutes. La réaction est pratiquement terminée après quinze minutes.

Introduire ensuite dans la fiole ou le ballon au moins 50 ml de la solution chlorhydrique, puis porter à nouveau à ébullition pendant dix minutes [voir remarque 3.2.2.6 d)].

Refroidir sous courant d'eau, ajouter ensuite dans la fiole ou le ballon 100 ml d'eau, puis verser le mélange dans une ampoule à décantation de 250 ml et ajouter 30 ml d'heptane (note 4). Agiter vigoureusement et laisser décanter jusqu'à séparation complète des deux phases. Recueillir la phase heptanique. Épuiser la phase aqueuse une seconde fois par 30 ml d'heptane. Réunir les deux extraits heptaniques et les laver plusieurs fois à l'eau jusqu'à neutralité. Après décantation, sécher sur sulfate de sodium. Filtrer sur coton et évaporer éventuellement jusqu'à 20 ml le solvant au bain d'eau bouillante avec barbotage d'azote dans une fiole conique de 100 ml (note 6, note 7).

3.2.2.5. Mode opératoire pour les acides gras

Pour les acides gras, il y a lieu d'utiliser le mode opératoire simplifié suivant:

En présence d'acides gras contenant des acides à plus de 2 doubles liaisons, il est recommandé d'éliminer l'air contenu dans le méthanol et dans le ballon par un barbotage d'azote pendant quelques minutes.

Préparer l'échantillon, conformément à «I. Préparations des échantillons».

Dans une fiole conique ou un ballon de 250 ml, introduire environ 4 g (note 5) de corps gras préparé.

Introduire 50 ml de la solution chlorhydrique et un régularisateur d'ébullition, adapter le réfrigérant, puis porter à ébullition pendant dix minutes.

Refroidir sous courant d'eau, ajouter ensuite dans la fiole ou le ballon 100 ml d'eau, puis verser le mélange dans une ampoule à décantation de 250 ml et ajouter 30 ml d'heptane (note 4). Agiter vigoureusement et laisser décanter jusqu'à séparation complète des deux phases. Soutirer la phase aqueuse et l'épuiser une seconde fois par 30 ml d'heptane. Réunir les deux extraits heptaniques et les laver plusieurs fois à l'eau jusqu'à neutralité. Après décantation, sécher sur sulfate de sodium. Filtrer sur coton et évaporer jusqu'à 20 ml le solvant au bain d'eau bouillante avec barbotage d'azote dans une fiole conique de 100 ml (note 6, note 7).

3.2.2.6. Remarques a) Au laboratoire, il est facile de préparer de petites quantités d'acide chlorhydrique gazeux anhydre par simple déplacement de sa solution commerciale (d = 1,18) en lui ajoutant peu à peu de l'acide sulfurique concentré (d = 1,84). Le gaz qui se dégage est simplement séché par barbotage dans de l'acide sulfurique.

Le méthanol étant très avide de gaz chlorhydrique, il est bon de prendre toutes les précautions d'usage pour la dissolution, par exemple d'effectuer l'introduction du gaz à l'aide d'un petit entonnoir renversé qui arrive juse à affleurement du niveau du méthanol. Il est d'ailleurs possible de préparer à l'avance des quantités importantes de solutions méthanoliques chlorhydriques qui se conservent parfaitement en flacons rodés maintenus à l'obscurité.

b) Il est possible d'utiliser de l'acide sulfurique méthanolique environ 1 N à la place de l'acide chlorhydrique méthanolique, mais la durée de l'estérification doit être d'au moins vingt minutes et les précipités de sulfate de sodium gênent l'ébullition et imposent la filtration ou l'emploi d'un agitateur magnétique.

c) Avant l'introduction de la prise d'essai, il est également possible de verser 40 ml de méthanol et d'ajouter 0,4 g de sodium, ce qui revient à préparer extemporanément une solution de méthylate de sodium.

d) Dans le cas de corps gras très acides, il se produit, compte tenu de la quantité relativement importante de méthylate de sodium, une précipitation de chlorure de sodium qui peut provoquer quelques soubresauts au cours de l'ébullition qui suit. Il est possible de filtrer ce précipité, mais ceci n'est généralement pas nécessaire en raison de la courte durée du chauffage préconisée.

4. MÉTHODES PARTICULIÈRES DE PRÉPARATION DES ESTERS MÉTHYLIQUES D'ACIDES GRAS AYANT 4 ATOMES DE CARBONE ET PLUS 4.1. Principe

Les esters méthyliques sont obtenus par réaction du corps gras avec une solution méthanolique d'hydroxyde de potassium en un stade intermédiaire avant que la saponification n'ait lieu.

4.2. Domaine d'application

La méthode est principalement destinée à la préparation des esters méthyliques devant être analysés par chromatographie en phase gazeuse. La méthode n'est pas applicable aux corps gras acides (indice d'acide > 2).

4.3. Matériel - tubes à essai à bouchon rodé d'environ 20 ml,

- fioles jaugées de 50 et 100 ml,

- pipettes graduées de 1 ml (ou plus),

- éprouvettes graduées de 10 ml.

4.4. Réactifs - solution méthanolique d'hydroxyde de potassium environ 2 N:

dissoudre 11,2 g d'hydroxyde de potassium dans 100 ml de méthanol ne contenant pas plus de 0,5 % (m/m) d'eau,

- heptane pour chromatographie (note 2, note 4),

- solution de référence I : dans une fiole jaugée de 50 ml, peser, à 0,1 mg près, 1 g de pentanoate de méthyle et porter au trait avec de l'heptane,

- solution de référence II : dans une fiole jaugée de 100 ml, peser, à 0,1 mg près, 200 mg de pentanoate de méthyle et porter au trait avec de l'heptane.

4.5. Mode opératoire

Si le dosage ultérieur de l'acide butyrique par chromatographie en phase gazeuse est requis, il y a lieu d'utiliser une solution de référence : solution de référence I si la teneur présumée en acide butyrique est supérieure à 1 %, solution de référence II si celle ci est inférieure à 1 %.

Dans le cas où la détermination de la composition en acides gras par chromatographie en phase gazeuse est requise, il n'y a pas lieu d'utiliser une solution de référence.

Préparer l'échantillon conformément à «I. Préparations des échantillons».

Dans un tube à essai à bouchon rodé d'environ 20 ml, peser, à 1 mg près, 1 g de l'échantillon préparé. Ajouter 10 ml d'heptane mesurés avec l'éprouvette graduée. Avec une pipette graduée, ajouter 1,0 ml de la solution de référence convenable.

Nota : Si le dosage de l'acide butyrique n'est pas requis, il n'est pas nécessaire de peser l'échantillon à 1 mg près ni d'ajouter la solution de référence.

Ajouter 0,5 ml de la solution méthanolique d'hydroxyde de potassium environ 2 N et mélanger le contenu du tube à essai par basculements jusqu'à ce que celui-ci devienne clair. Ceci demande environ vingt secondes. Presque aussitôt après cette clarification, la solution devient de nouveau trouble par suite de la séparation du glycérol. La décantation du glycérol se produit également.

Décanter la couche supérieure contenant les esters méthyliques.

5. NOTES 1. Si l'insaponifiable est gênant, diluer avec de l'eau la solution obtenue après saponification et éliminer l'insaponifiable par extraction à l'oxyde diéthylique, l'hexane ou l'éther de pétrole dans les conditions classiques.

Acidifier la solution savonneuse aqueuse et séparer les acides gras. Préparer les esters méthyliques de ceux-ci selon les procédés 3.1.4.2 ou 3.2.3.5.

2. Lors de la chromatographie en phase gazeuse des esters méthyliques, certains réactifs et notamment les solutions méthanoliques de trifluorure de bore peuvent conduire à l'apparition de pics parasites (dans la région C20-C22 pour les solutions méthanoliques de trifluorure de bore). Par suite, chaque nouveau lot de réactif doit être testé en préparant des esters méthyliques de l'acide oléique pur, puis en chromatographiant ceux-ci. S'il apparaît un pic parasite, le réactif utilisé doit être éliminé.

Les divers réactifs ne doivent pas donner le pic interférant avec ceux des esters méthyliques d'acides gras au cours de la chromatographie en phase gazeuse.

3. S'il est absolument indispensable de préparer une solution méthanolique de trifluorure de bore, à partir de trifluorure de bore gazeux, opérer comme suit : Tarer une fiole de deux litres contenant un litre de méthanol. Refroidir dans un bain d'eau glacée. La fiole restant dans le bain, faire barboter BF3 provenant d'une bouteille à gaz par l'intermédiaire d'un tube de verre dans le méthanol jusqu'à absorption de 125 g, en opérant sous une hotte. Faire passer le courant de BF3 dans le tube de verre avant de plonger celui-ci dans le méthanol et jusqu'à ce qu'il soit retiré, afin de prévenir tout retour de liquide dans le système détendeur de gaz. Le gaz ne devrait pas en s'échappant trop vite de la fiole, donner de fumées blanches. Le réactif est stable deux ans.

4. L'heptane (mélange d'isomères C7 purs testé par chromatographie en phase gazeuse) peut être remplacé par de l'hexane en l'absence d'acides gras à 20 atomes de carbone et plus.

5. Si l'on ne dispose pas de la masse de prise d'essai prévue, celle-ci peut être réduite jusqu'à 10 mg et même moins, à condition de diminuer proportionnellement les volumes de réactifs et la capacité de l'appareillage.

6. Les esters méthyliques doivent de préférence être analysés le plus rapidement possible. Si nécessaire, la solution heptanique contenant les esters méthyliques peut être conservée sous gaz inerte et au réfrigérateur. Pour un stockage de longue durée, il est souhaitable de protéger les esters méthyliques contre l'autoxydation par addition à la solution d'un antioxygène à une concentration n'interférant pas dans les analyses ultérieures, par exemple 0,005 % (m/v) de BHT (di t.butyl-2-6 méthyl-4 phénol). Si nécessaire, les esters méthyliques secs et sans solvant peuvent éventuellement être conservés vingt-quatre heures sous gaz inerte au réfrigérateur, ou plus longtemps en tube scellé sous vide au congélateur.

7. Il y a un risque de perdre une partie des esters méthyliques les plus volatils si l'élimination du solvant est prolongée ou si le courant d'azote est trop vigoureux.

Pour la spectrophotométrie infrarouge, cette élimination du solvant doit être la plus complète possible. Pour la chromatographie en phase gazeuse, il est souhaitable de ne pas chasser le solvant.

8. Dans le cas d'huile du type huile de ricin, la limpidité n'est pas le critère de réaction.

III. CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE DES ESTERS MÉTHYLIQUES D'ACIDES GRAS

1. PRÉAMBULE

La présente méthode a pour objet de donner des directives générales pour la détermination par chromatographie en phase gazeuse de la composition qualitative et quantitative d'un mélange d'esters méthyliques d'acides gras obtenu selon le titre II. Les acides gras polymérisés ne sont pas analysables par cette méthode.

Les prescriptions fournies concernent les appareillages usuels de chromatographie en phase gazeuse avec colonne à remplissage et détecteur à ionisation de flamme (note 1).

2. MATÉRIEL 2.1. Appareil de chromatographie en phase gazeuse

Tout appareillage permettant d'obtenir l'efficacité et la résolution telles qu'elles sont définies au point 4.1.2 est convenable. 2.1.1. Dispositif d'injection

Le dispositif d'injection doit avoir le plus faible volume mort possible. Sauf impossibilité matérielle, il sera porté à une température supérieure de 25 à 50 ºC à celle de la colonne.

2.1.2. Four

Le four doit être susceptible de porter les colonnes à une température d'au moins 220 ºC et de maintenir la température choisie à 1 ºC près.

Dans le cas d'utilisation de conditions programmées, il est conseillé de choisir un appareil à double colonne.

2.1.3. Colonne 2.1.3.1. Tube

Tube en matériau inerte vis-à-vis des corps à analyser : verre ou, à défaut, acier inoxydable (note 2).

Longueur : de 1 à 3 m. Une colonne relativement courte sera utilisée dans le cas où les acides gras à longue chaîne (> C20) sont présents.

Dans le cas de la détermination des acides en C4 et C6, il est recommandé d'utiliser une colonne de 2 m.

Diamètre intérieur : de 2 à 4 mm.

2.1.3.2. Remplissage

Support : terre de diatomées lavée aux acides et silanisée, ou tout autre support inerte pouvant convenir, avec un étroit intervalle de granulométrie (25 ¶m entre 125 et 200 ¶m), la valeur moyenne étant liée au diamètre intérieur et à la longueur de la colonne.

Phase stationnaire : phase polaire de type polyester (par exemple polysyccinate de diéthylèneglycol, polysuccinate de butanediol, polyadipate d'éthylèneglycol, etc.) ou tout autre phase répondant aux exigences ci-dessous (par exemple cyanosilicones, etc.). Le taux d'impregnation sera compris entre 5 et 20 %. Pour certaines séparations, des phases apolaires pourront être utilisées.

2.1.3.3. Conditionnement

Après avoir déconnecté, si possible, la colonne du détecteur, porter le four de l'appareil à 10 ºC au-dessus de la température de travail et maintenir la colonne venant d'être préparée sous un courant de gaz inerte de 20 à 60 ml/min pendant au moins seize heures à cette température, puis pendant deux heures à 195 ºC.

2.1.4. Détecteur

Le détecteur sera de préférence susceptible d'être porté à une température supérieure à celle de la colonne.

Les détails opératoires donnés ci-dessous concernent l'emploi d'un détecteur à ionisation de flamme (note 1).

2.2. Seringue

Seringue de 10 ¶l au maximum, divisée en dixièmes de ¶l.

2.3. Enregistreur

Lorsque la courbe enregistrée est utilisée pour calculer la composition du mélange analysé, l'enregistreur doit être un appareil électronique de grande précision compatible avec l'appareillage utilisé: - vitesse de réponse inférieure à 1,5 sec, de préférence à 1 sec (la vitesse de réponse est le temps nécessaire pour que la plume de l'enregistreur aille de 0 à 90 % lors de l'introduction momentanée d'un signal de 100 %),

- largeur du papier 25 cm minimum,

- vitesse de déroulement du papier : 25 à 150 cm/h.

2.4. Intégrateur ou calculateur (facultatif)

L'emploi d'un intégrateur électronique ou d'un calculateur permet un calcul rapide et précis. Celui-ci doit fournir une réponse linéaire, avoir une sensibilité suffisante et la correction de la déviation de la ligne de base doit être satisfaisante.

3. RÉACTIFS - gaz vecteur : gaz inerte (azote, hélium, argon, etc.) très bien desséché et contenant moins de 10 ppm d'oxygène,

- gaz auxiliaires : hydrogène à 99,9 % minimum ne contenant pas de produits organiques, air ou oxygène ne contenant pas de produits organiques,

- produits d'étalonnage mélange d'esters méthyliques ou esters méthyliques d'une huile de composition connue, si possible voisine de celle du corps gras à analyser.

4. MODE OPÉRATOIRE 4.1. Réglage de l'appareil 4.1.1. Détermination des conditions optimales de travail

Pour choisir les conditions de travail, il y a lieu de tenir compte des variables suivantes: - longueur et diamètre de la colonne,

- nature et quantité de la phase stationnaire,

- température de la colonne,

- débit du gaz vecteur,

- résolution souhaitée,

- importance de la prise d'essai,

- durée de l'analyse.

L'importance de la prise d'essai sera choisie de façon telle que l'ensemble détecteur-électromètre fournisse une réponse linéaire.

En général, les valeurs suivantes seront celles donnant les résultats désirés, à savoir nombre de plateaux théoriques pour le stéarate de méthyle au moins égal à 2 000 et élution de celui-ci en quinze minutes environ >PIC FILE= "T0011219">

Lorsque l'appareil le permet, l'injecteur sera à une température voisine de 200 ºC et le détecteur à une température égale ou supérieure à celle de la colonne.

Le débit d'hydrogène du détecteur à ionisation de flamme est, en général, d'environ la moitié de celui du gaz vecteur et velui d'oxygène de 5 à 10 fois celui de l'hydrogène.

4.1.2. Détermination de l'efficacité et de la résolution

Effectuer l'analyse d'un mélange de stéarate et d'oléate de méthyle en proportions sensiblement équivalentes (par exemple, esters méthyliques de beurre de cacao). L'importance de la prise d'essai, la température de la colonne et le débit du gaz vecteur seront choisis de façon que le maximum du pic de stéarate de méthyle soit enregistré environ quinze minutes après le pic du solvant et que ce pic corresponde à environ les trois quarts de l'échelle totale. >PIC FILE= "T0011220">

4.2. Analyse

La prise d'essai sera de 0,1 à 2 ¶l de la solution heptanique des esters méthyliques obtenue selon le titre II. Dans le cas d'esters exempts de solvants, en faire une solution à 10 % environ dans l'heptane et injecter 0,1 à 1 ¶l de celle-ci.

Pour la recherche de constituants présents à l'état de traces, cette prise d'essai pourra être augmentée (jusqu'à 10 fois) ; dans les cas usuels, les conditions opératoires seront celles déterminées au point 4.1.1. Il sera toutefois possible d'opérer avec une température de colonne plus basse dans le cas où il est nécessaire de doser des acides gras inférieurs à C12, ou plus élevée dans le cas où il est nécessaire de doser des acides gras supérieurs à C20.

Éventuellement, il est possible d'opérer en température programmée dans les deux cas précédents. Par exemple, si l'échantillon contient des esters méthyliques d'acides gras à moins de 12 atomes de carbone, injecter l'échantillon à 100 ºC (ou à 50-60 ºC si l'acide butyrique est présent) et programmer immédiatement à 4-8 ºC/min jusqu'à la température optimale.

Dans certains cas les deux procédés peuvent être combinés : après la période de programmation de température, continuer l'élution à température constante jusqu'à élution de tous les constituants. Si l'appareil ne peut pas travailler en température programmée, opérer à deux températures fixes entre 100 et 195 ºC.

Si nécessaire, il est recommandé de faire une analyse sur deux phases fixes de polarités différentes pour vérifier l'absence de pics masqués, par exemple pour les huiles de poissons ou dans le cas de la présence simultanée de C18 : 3 et C20 : 0 ou de C18 : 3 et de C18 : 2 conjugués.

5. EXPRESSION DES RÉSULTATS 5.1. Analyse qualitative

Dans des conditions opératoires identiques à celles de l'essai, analyser le mélange témoin, de composition connue, et déterminer les distances de rétention (ou les temps de rétention) pour les acides gras constitutifs. Tracer les courbes donnant le logarthime de la distance de rétention (ou du temps de rétention) en fonction du nombre d'atomes de carbone ; dans des conditions isothermes et pour des esters à chaîne droite et un taux d'insaturation fixé, ces courbes tracées sur papier semi-logarithmique doivent être des droites sensiblement parallèles.

Pour l'essai, indentifier les pics en se reportant à ces droites, au besoin en interpolant.

Il y a lieu d'éviter les conditions opératoires telles que des «pics masqués» existent, c'est-à-dire que deux constituants ne puissent être distingués par suite d'une résolution insuffisante.

5.2. Analyse quantitative 5.2.1. Détermination de la composition

Utiliser la méthode de normalisation interne (sauf exceptions), c'est-à-dire admettre que la totalité des constituants présents dans l'échantillon est représentée sur le chromatogramme, donc que la somme des aires des pics représente 100 % des constituants (élution totale).

Si l'appareillage comporte un intégrateur, utiliser les chiffres fournis par celui-ci. Dans le cas contraire, déterminer l'aire de chaque pic par triangulation en multipliant la hauteur de celui-ci par sa largeur à mi-hauteur, en tenant éventuellement compte des diverses atténuations utilisées au cours de l'enregistrement.

>PIC FILE= "T0011221">

5.2.2. Expression des résultats

Donner le résultat avec:

3 chiffres significatifs au-dessus de 10 %,

2 chiffres significatifs entre 1 et 10 %,

1 chiffre significatif en dessous de 1 %,

c'est-à-dire dans chaque cas avec un chiffre après la virgule.

5.2.3. Répétabilité

La différence entre les résultats de 2 déterminations effectuées le même jour avec le même appareil par la même personne et sur les mêmes esters et pour les constituants présents à plus de 5 % ne doit pas excéder en valeur relative 3 % de la valeur déterminée, avec un maximum absolu de 1 %. Pour les constituants présents à moins de 5 %, la répétabilité devient rapidement moins bonne en valeur relative lorsque la teneur diminue.

5.2.4. Reproductibilité

La différence entre les résultats obtenus dans deux laboratoires différents pour les constituants présents à plus de 5 % ne doit pas excéder en valeur relative 10 % de la valeur déterminée, avec un maximum absolu de 3 %. Pour les constituants présents à moins de 5 %, la reproductibilité devient rapidement moins bonne en valeur relative lorsque la teneur diminue.

6. NOTES 1. Un appareil de chromatographie en phase gazeuse avec un détecteur à conductibilité thermique (catharomètre) peut être utilisé. Les conditions décrites doivent alors être modifiés comme suit: >PIC FILE= "T0011343">

Pour l'analyse quantitative, tenir compte des facteurs de correction définis au point 5.2.1.2.

2. Si les constituants polyinsaturés à plus de 3 doubles liaisons sont présents, un tube en acier inoxydable peut provoquer des décompositions de ceux-ci.

Amendments and corrections
July 1, 1996	See 31968R1470
January 1, 1981	Corrected by 31977R0072R(01)
January 18, 1977	Entry into force - Date pub. + 3 See Art 3

Commission Regulation (EEC) No 72/77 of 13 January 1977 amending Regulation (EEC) No 1470/68 on the drawing and reduction of samples and the determination of oil content, impurities and moisture in oil seeds