COMMISSION SIXIÈME DIRECTIVE DE LA COMMISSION du 20 décembre 1974 portant fixation de méthodes d'analyse communautaires pour le contrôle officiel des aliments des animaux (75/84/CEE)

LA COMMISSION DES COMMUNAUTÉS EUROPÉENNES,

vu le traité instituant la Communauté économique européenne,

vu la directive du Conseil, du 20 juillet 1970, concernant l'introduction de modes de prélèvement d'échantillons et de méthodes d'analyse communautaires pour le contrôle officiel des aliments des animaux (1), modifiée en dernier lieu par l'acte (2), joint au traité relatif à l'adhésion de nouveaux États membres à la Communauté économique européenne et à la Communauté européenne de l'énergie atomique (3) signé à Bruxelles le 22 janvier 1972, et notamment son article 2,

considérant que la directive susvisée prévoit que les contrôles officiels des aliments des animaux pour constater si les conditions prescrites en vertu des dispositions législatives, réglementaires ou administratives concernant la qualité et la composition des aliments des animaux sont respectées, sont effectués selon des modes de prélèvement d'échantillons et des méthodes d'analyse communautaires;

considérant que les directives nº 71/250/CEE, nº 71/393/CEE, nº 72/199/CEE, nº 73/46/CEE et nº 74/203/CEE de la Commission, des 15 juin 1971 (4), 18 novembre 1971 (5), 27 avril 1972 (6), 5 décembre 1972 (7) et 25 mars 1974 (8) ont déjà fixé un certain nombre de méthodes d'analyse communautaires ; que, compte tenu de l'état d'avancement des travaux effectués depuis lors, il convient d'arrêter une sixième série de méthodes;

considérant que les mesures prévues dans la présente directive sont conformes à l'avis du comité permanent des aliments des animaux,

A ARRÊTÉ LA PRÉSENTE DIRECTIVE:

Article premier

Les États membres prescrivent que les analyses pour les contrôles officiels des aliments des animaux, en ce qui concerne leurs teneurs en buquinolate, sulfaquinoxaline et furazolidone sont effectuées selon les méthodes décrites à l'annexe de la présente directive.

Les dispositions générales figurant à la partie 1 (introduction) de l'annexe de la première directive nº 71/250/CEE de la Commission, du 15 juin 1971, à l'exception de la partie concernant la préparation de l'échantillon à analyser, sont applicables aux méthodes décrites à l'annexe de la présente directive.

Article 2

Les États membres mettent en vigueur, le 1er novembre 1975 au plus tard, les dispositions législatives, réglementaires ou administratives nécessaires pour se conformer aux dispositions de la présente directive. Ils en informent immédiatement la Commission.

Article 3

Les États membres sont destinataires de la présente directive.

Fait à Bruxelles, le 20 décembre 1974.

Par la Commission

Le président

François-Xavier ORTOLI (1)JO nº L 170 du 3.8.1970, p. 2. (2)JO nº L 73 du 27.3.1972, p. 14. (3)JO nº L 73 du 27.3.1972, p. 5. (4)JO nº L 155 du 12.7.1971, p. 13. (5)JO nº L 279 du 20.12.1971, p. 7. (6)JO nº L 123 du 29.5.1972, p. 6. (7)JO nº L 83 du 30.3.1973, p. 21. (8)JO nº L 108 du 22.4.1974, p. 7.

ANNEXE

1. DOSAGE DU BUQUINOLATE (éthyl-4-hydroxy-6,7-diisobutoxy-3-quinoléine carboxylate)

1. Objet et domaine d'application

La méthode permet de doser le buquinolate dans les aliments, les concentrats et les prémélanges. La limite inférieure du dosage est de 10 ppm. Le décoquinate interfère dans le dosage.

2. Principe

L'échantillon est soumis à l'extraction par du chloroforme. L'extrait est évaporé à sec, le résidu est repris par du chloroforme et la solution est soumise ensuite à une chromatographie sur couche mince. Le buquinolate est élué par de l'éthanol et déterminé par spectrophotofluorimétrie par comparaison avec des solutions étalons.

3. Réactifs 3.1. Chloroforme p.a.

3.2. Ethanol à 96 p. cent (v/v) p.a.

3.3. Mélange de chloroforme et d'éthanol : mélanger 10 volumes de chloroforme (3.1) et 1 volume d'éthanol (3.2).

3.4. Ethanol à 80 p. cent (v/v) p.a.

3.5. Gel de silice G pour chromatographie sur couche mince.

3.6. Substance étalon : buquinolate pur.

3.7. Solutions étalons: 3.7.1. Solution étalon à 0,2 mg de buquinolate par ml:

Peser à 0,1 mg près, 50 mg de substance étalon (3.6).

Dissoudre par du chloroforme (3.1) dans un ballon jaugé de 250 ml en chauffant sur bain d'eau à 50 ºC. Laisser refroidir jusqu'à température ambiante, compléter au volume par du chloroforme (3.1) et homogénéiser.

3.7.2. Solutions étalons de travail : Prélever des volumes respectifs de 5,0 - 10,0 - 15,0 - 20,0 et 25,0 ml de la solution (3.7.1) et les introduire dans des ballons jaugés de 25 ml. Compléter au volume par du chloroforme (3.1) et homogénéiser. Préparer au moment de l'emploi. Ces solutions contiennent respectivement 0,04 - 0,08 - 0,12 - 0,16 et 0,20 mg de buquinolate par ml.

4. Appareillage 4.1. Fioles coniques de 50 et 250 ml, à bouchon rodé.

4.2. Agitateur.

4.3. Centrifugeuse, avec tubes de 15 ml, à bouchon rodé.

4.4. Bain d'eau à 50 ºC.

4.5. Appareillage pour chromatographie sur couche mince.

4.6. Plaques de verre pour chromatographie sur couche mince, 200 × 200 mm, préparées comme suit. Étendre uniformément sur les plaques une couche de 0,5 mm d'épaisseur de gel de silice G (3.5), et laisser sécher durant 15 minutes à l'air. Maintenir ensuite les plaques durant 2 heures dans l'étuve (4.11), puis les transférer dans un dessicateur muni de gel de silice déshydratant. Les plaques à l'emploi conviennent dans la mesure où elles donnent des résultats semblables à ceux des plaques traitées comme indiqué ci-dessus.

4.7. Micropipettes de 0,50 ml.

4.8. Collecteur de zones pour chromatographie sur couche mince.

4.9. Lampe UV à ondes courtes.

4.10. Spectrophotofluorimètre équipé d'une lampe Xénon et de deux monochromateurs.

4.11. Étuve munie d'un ventilateur et réglée à 100 ºC.

4.12. Appareil rotatif à évaporation sous vide, avec ballon de 250 ml.

5. Mode opératoire 5.1. Préparation de l'échantillon

Broyer l'échantillon de façon qu'il passe en totalité au travers d'un tamis à mailles de 1 mm (conforme à la recommandation ISO R 565).

5.2. Extraction

Peser, à 1 mg près, une quantité de l'échantillon divisé et homogénéisé contenant 1,25 mg environ de buquinolate. Introduire la prise d'essai dans une fiole conique de 250 ml (4.1) et ajouter 100,0 ml de chloroforme (3.1). Mélanger, boucher la fiole et agiter durant 1 heure à l'aide de l'agitateur (4.2). Laisser décanter, filtrer et éliminer les premiers ml du filtrat.

Introduire 80,0 ml du filtrat limpide dans un becher de 150 ml ou dans le ballon de l'appareil rotatif (4.12). Évaporer presque à sec sur bain d'eau (4.4), reprendre le résidu huileux à plusieurs reprises par quelques ml de chloroforme (3.1) et transvaser quantitativement les liquides dans un ballon jaugé de 10 ml à l'aide d'un entonnoir à tige mince. Compléter au volume par du chloroforme (3.1) et homogénéiser. Si la solution n'est pas limpide, centrifuger durant 3 minutes à 3 000 t/m en tube bouché.

5.3. Chromatographie sur couche mince

Déposer ponctuellement sur une plaque pour chromatographie sur couche mince (4.6), à l'aide d'une micropipette (4.7) et à des distances respectives de 2 cm, des volumes de 0,25 ml de l'extrait obtenu en 5.2 et des cinq solutions étalons de travail (3.7.2).

Développer le chromatogramme par du chloroforme (3.1) jusqu'à ce que le front de solvant atteigne pratiquement le bord supérieur de la plaque, puis sécher à l'aide d'un courant d'air. Développer ensuite par le mélange chloroforme/éthanol (3.3) jusqu'à ce que le front de solvant ait migré de 12 cm environ. Laisser évaporer les solvants. Irradier le chromatogramme par la lumière UV (4.9) et délimiter les taches de buquinolate (valeur Rf : 0,4 à 0,6) à l'aide d'une aiguille.

5.4. Élution

Récolter la silice de chaque zone délimitée, à l'aide d'un collecteur de zones (4.8), dans un tube à centrifuger (4.3). Ajouter dans chaque tube 10,0 ml d'éthanol (3.4), agiter durant 20 minutes, puis centrifuger durant 5 minutes à 3 000 t/m. Décanter les solutions limpides dans des fioles coniques de 50 ml (4.1).

5.5. Mesure de la fluorescence

Régler à 100 l'échelle du spectrophotofluorimètre (4.10) à l'aide de l'éluat (5.4) provenant de la solution étalon la plus concentrée, en utilisant pour l'excitation la longueur d'onde comprise entre 200 et 280 nm donnant la fluorescence la plus intense et pour l'émission la longueur d'onde de 375 nm.

Mesurer dans ces conditions l'intensité de fluorescence des autres éluats (5.4). Déterminer à partir des valeurs trouvées la quantité (A) du buquinolate en mg contenue dans les 10 ml d'éluat issu de l'échantillon.

6. Calcul des résultats

La teneur en mg de buquinolate par kg d'échantillon est donnée par la formule >PIC FILE= "T0006682">

dans laquelle:

A = quantité en mg de buquinolate déterminée par la mesure spectrofluorimétrique.

P = poids en g de la prise d'essai.

7. Répétabilité

La différence entre les résultats de deux déterminations parallèles effectuées sur le même échantillon ne doit pas dépasser:

50 p. cent du résultat le plus élevé pour les teneurs en buquinolate comprises entre 10 et 20 ppm;

10 ppm, en valeur absolue, pour les teneurs comprises entre 20 et 100 ppm;

10 p. cent du résultat le plus élevé pour les teneurs comprises entre 100 et 5 000 ppm;

500 ppm, en valeur absolue, pour les teneurs comprises entre 5 000 et 10 000 ppm;

5 p. cent du résultat le plus élevé pour les teneurs supérieures à 10 000 ppm.

2. DOSAGE DE LA SULFAQUINOXALINE (2-sulfanylamidoquinoxaline)

1. Objet et domaine d'application

La méthode permet de doser la sulfaquinoxaline dans les aliments, les concentrats et les prémélanges. La limite inférieure du dosage est de 20 ppm. D'autres sulfonamides ainsi que l'acide arsanilique interfèrent dans le dosage.

2. Principe

L'échantillon est soumis à l'extraction par la diméthylformamide et le chloroforme. La sulfaquinoxaline est hydrolysée en milieu alcalin. Après neutralisation, le dérivé aminé formé est diazoté et couplé avec la N-(1-naphtyl) éthylènediamine. La densité optique de la solution est mesurée à 545 nm.

3. Réactifs 3.1. N,N-diméthylformamide p.a.

3.2. Chloroforme p.a.

3.3. Éthanol absolu.

3.4. Lessive alcaline : Dissoudre dans l'eau 10 g d'hydroxyde de sodium p.a. et 25 g de chlorure de sodium p.a. Compléter à 500 ml par de l'eau et homogénéiser.

3.5. Acide chlorhydrique concentré p.a. (d = 1,18).

3.6. Solution à 0,1 p. cent (p/v) de nitrite de sodium : Dissoudre dans l'eau 100 mg de nitrite de sodium p.a., compléter à 100 ml par de l'eau et homogénéiser. Préparer immédiatement avant l'emploi.

3.7. Solution à 0,5 p. cent (p/v) de sulfamate d'ammonium : Dissoudre dans l'eau 500 mg de sulfamate d'ammonium p.a., compléter à 100 ml par de l'eau et homogénéiser. Préparer immédiatement avant l'emploi.

3.8. Solution à 0,1 p. cent (p/v) de dichlorhydrate de N-(1-naphtyl) éthylènediamine : Dissoudre dans de l'acide chlorhydrique p.a. à 0,1 p. cent (v/v) 100 mg de dichlorhydrate de N-(1-naphtyl)éthylènediamine p.a., compléter à 100 ml par le même acide et homogénéiser. Préparer immédiatement avant l'emploi.

3.9. Substance étalon : sulfaquinoxaline pure.

3.10. Solution étalon : Peser, à 0,1 mg près, 250 mg de substance étalon (3.9). Dissoudre dans 50 ml d'une solution d'hydroxyde de sodium (25 ml de solution d'hydroxyde de sodium p.a. 0,1 N + 25 ml d'eau), compléter à 500 ml par de l'eau et homogénéiser. Prélever 5,0 ml de cette solution et diluer à 100 ml avec de l'eau. 1 ml de cette solution contient 25 microgrammes de sulfaquinoxaline.

4. Appareillage 4.1. Fioles coniques de 250 ml, à rodage normalisé.

4.2. Agitateur.

4.3. Creuset filtrant, porosité 3, diamètre : 80 mm, avec fiole à vide.

4.4. Ampoules à décanter de 250 ml.

4.5. Ballons jaugés de 50, 100, 250 et 500 ml.

4.6. Tubes à essai, 150 mm × 25 mm.

4.7. Bain d'eau bouillante.

4.8. Spectrophotomètre, avec cuvettes de 20 mm d'épaisseur.

5. Mode opératoire 5.1. Préparation de l'échantillon

Broyer l'échantillon de façon qu'il passe en totalité au travers d'un tamis à mailles de 1 mm (conforme à la recommandation ISO R 565).

5.2. Extraction

Peser, à 1 mg près, une quantité de l'échantillon divisé et homogénéisé contenant de 0,25 à 1,25 mg de sulfaquinoxaline. Introduire la prise d'essai dans une fiole conique de 250 ml (4.1) et ajouter 20 ml de N,N-diméthylformamide (3.1). Mélanger et chauffer durant 20 minutes sur bain d'eau (4.7). Laisser refroidir sous un courant d'eau froide. Ajouter 60 ml de chloroforme (3.2), boucher la fiole et agiter durant 30 minutes à l'aide de l'agitateur (4.2).

Filtrer le liquide sur un creuset filtrant (4.3) en aspirant légèrement. Rincer la fiole par quatre portions de 5 ml de chloroforme (3.2) et transvaser les liquides dans le creuset filtrant. Transvaser ensuite le filtrat dans une ampoule à décanter (4.4), rincer le flacon à l'aide de 15 ml environ de chloroforme (3.2) et transvaser le liquide dans l'ampoule.

5.3. Hydrolyse

Ajouter dans l'ampoule 50 ml de lessive alcaline (3.4) et 5 ml d'éthanol (3.3). Mélanger complètement en évitant la formation d'émulsion soit en inversant l'ampoule une vingtaine de fois, soit en la faisant pivoter autour de l'axe horizontal passant de la tige au bouchon. Laisser ensuite reposer jusqu'à séparation des phases (la séparation est généralement complète après 15 minutes environ).

Transvaser la phase supérieure (phase aqueuse) dans un ballon jaugé de 250 ml (4.5). Extraire à nouveau la phase chloroformique par trois portions de 50 ml de lessive alcaline (3.4) et transvaser après chaque extraction l'extrait aqueux dans le ballon jaugé. Compléter au volume par de l'eau et homogénéiser.

Introduire 25,0 ml de la solution dans un ballon jaugé de 50 ml (4.5), ajouter 5,0 ml d'acide chlorhydrique (3.5), compléter au volume par de l'eau et homogénéiser. Filtrer, si nécessaire, et éliminer les 15 premiers ml du filtrat. Introduire 10,0 ml de la solution respectivement dans deux tubes à essai (4.6) A et B.

5.4. Développement de la coloration et mesure de la densité optique

Ajouter dans chaque tube 2,0 ml de solution de nitrite de sodium (3.6), agiter et laisser reposer 3 minutes. Ajouter 2,0 ml de solution de sulfamate d'ammonium (3.7), agiter et laisser reposer 2 minutes. Ajouter ensuite 1,0 ml de solution de dichlorhydrate de N-(1-naphtyl) éthylènediamine (3.8) dans le tube A et 1,0 ml d'eau dans le tube B. Mélanger intimement le contenu de chaque tube. Relier les tubes à une trompe à eau à l'aide de joints de caoutchouc et appliquer un léger vide pour éliminer l'azote dissous.

Mesurer après 10 minutes les densités optiques EA et EB des solutions au spectrophotomètre (4.8) à 545 nm par comparaison avec de l'eau. Déterminer à partir de la valeur EA - EB la quantité (A) de sulfaquinoxaline présente dans la solution de l'échantillon en se référant à la courbe d'étalonnage (5.5) établie au préalable.

5.5. Courbe d'étalonnage

Introduire dans des ballons jaugés de 100 ml (4.5) des volumes respectifs de 2,0 - 4,0 - 6,0 - 8,0 et 10,0 ml de la solution étalon (3.10) correspondant à 50, 100, 150, 200 et 250 microgrammes de sulfaquinoxaline. Ajouter 8 ml d'acide chlorhydrique (3.5) dans chaque ballon, compléter au volume par de l'eau et homogénéiser.

Prélever 10,0 ml de chaque solution (ce qui correspond respectivement à 5, 10, 15, 20 et 25 microgrammes de sulfaquinoxaline) et les introduire dans des tubes à essai (4.6). Développer la coloration comme indiqué en 5.4, premier paragraphe. Mesurer ensuite les densités optiques à 545 nm par comparaison avec de l'eau. Tracer la courbe d'étalonnage en portant en ordonnée les valeurs de la densité optique et en abscisse les quantités correspondantes de sulfaquinoxaline en microgrammes.

6. Calcul des résultats

La teneur en mg de sulfaquinoxaline par kg d'échantillon est donnée par la formule >PIC FILE= "T0006683">

dans laquelle

A = quantité en microgrammes de sulfaquinoxaline, déterminée par la mesure photométrique;

P = poids en grammes de la prise d'essai.

7. Répétabilité

La différence entre les résultats de deux déterminations parallèles effectuées sur le même échantillon ne doit pas dépasser:

10 ppm, en valeur absolue, pour les teneurs en sulfaquinoxaline comprises entre 20 et 100 ppm;

10 p. cent du résultat le plus élevé pour les teneurs comprises entre 100 et 5 000 ppm;

500 ppm, en valeur absolue, pour les teneurs comprises entre 5 000 et 10 000 ppm;

5 p. cent du résultat le plus élevé pour les teneurs supérieures à 10 000 ppm.

3. DOSAGE DE LA FURAZOLIDONE [N-(5-nitro-2-furfurylidène)-3-amino-2-oxazolidone]

1. Objet et domaine d'application

La méthode permet de doser la furazolidone dans les aliments, les concentrats et les prémélanges. La limite inférieure du dosage est de 10 ppm.

2. Principe

La furazolidone est extraite par de l'acétone, après un dégraissage préliminaire de l'échantillon par de l'éther de pétrole. L'extrait est purifié par chromatographie sur colonne d'oxyde d'aluminium et la furazolidone est éluée par l'acétone. L'éluat est évaporé à sec et le résidu est repris par de l'alcool amylique. La furazolidone en est extraite par une solution d'urée et la densité optique de l'extrait est mesuré à 375 nm.

3. Réactifs 3.1. Acétone p.a.

3.2. Oxyde d'aluminium pour chromatographie, neutre,

granulométrie : 100 à 240 mesh, préparé comme suit. Mélanger 500 g d'oxyde d'aluminium avec 1 l d'eau distillée chaude et décanter ensuite le liquide surnageant. Répéter deux fois cette opération et filtrer ensuite sur un entonnoir Buchner. Sécher l'oxyde d'aluminium à 105 ºC jusqu'à poids constant.

3.3. Acétate d'amyle p.a.

3.4. Alcool amylique p.a. (les mélanges d'isomères conviennent).

3.5. Éther de pétrole, éb. 40-60 ºC.

3.6. Solution d'urée : Mélanger 90 g d'urée p.a. avec 100 ml d'eau, chauffer légèrement pour dissoudre complètement.

3.7. Substance étalon : furazolidone pure.

3.8. Solution étalon : Peser, à 0,1 mg près, 25 mg de substance étalon (3.7). Dissoudre dans l'acétone (3.1) dans un ballon jaugé de 250 ml (4.1), compléter au volume par de l'acétone (3.1) et homogénéiser. 1 ml de cette solution contient 100 microgrammes de furazolidone.

4. Appareillage 4.1. Ballons jaugés de verre brun, 100 et 250 ml.

4.2. Ampoules à décanter de verre brun, 100 ml.

4.3. Appareils à extraction, par ex. : Soxhlet ou Twisselmann.

4.4. Cartouches à extraction, 25 × 80 mm ou 28 × 100 mm.

4.5. Tubes pour chromatographie, en verre, diamètre intérieur : 10 mm, longueur : 300 mm.

4.6. Bain d'eau bouillante.

4.7. Spectrophotomètre avec cuvettes de 10 mm d'épaisseur.

5. Mode opératoire

NB Toutes les manipulations doivent être effectuées à l'abri de la lumière directe. 5.1. Préparation de l'échantillon

Broyer l'échantillon de façon qu'il passe en totalité au travers d'un tamis à mailles de 1 mm (conforme à la recommandation ISO R 565).

5.2. Extraction

Peser, à 1 mg près, 5 à 20 g de l'échantillon divisé et homogénéisé (contenant au maximum 1 mg de furazolidone) dans une cartouche à extraction (4.4), placer celle-ci dans un appareil à extraction (4.3) et extraire par de l'éther de pétrole (3.5). Pour l'appareil de Soxhlet, 13 à 17 cycles de solvant sont nécessaires ; pour d'autres appareils, la durée de l'extraction ne doit pas être inférieure à 30 minutes. Retirer ensuite la cartouche de l'appareil, éliminer le solvant résiduel et sécher la cartouche et son contenu à l'aide d'un courant d'air chaud.

Placer ensuite la cartouche et son contenu dans un appareil à extraction propre et extraire par de l'acétone (3.1). Pour l'appareil de Soxhlet, 25 cycles au moins de solvant sont nécessaires ; pour d'autres appareils, les conditions nécessaires à l'obtention d'une extraction complète doivent être déterminées au préalable. Évaporer l'extrait acétonique sur le bain d'eau (4.6) jusqu'à un volume de 5 à 10 ml et laisser refroidir ensuite jusqu'à température ambiante.

5.3. Chromatographie

Introduire un tampon de laine de verre dans l'extrémité inférieure d'un tube pour chromatographie (4.5) et tasser le tampon à l'aide d'une baguette appropriée pour obtenir une épaisseur de 2 à 3 mm. Préparer ensuite une suspension d'oxyde d'aluminium (3.2) dans l'acétone (3.1), introduire la suspension dans le tube et laisser déposer. La colonne ainsi obtenue doit avoir une hauteur de 200 mm environ. Laisser descendre l'acétone jusqu'à la surface supérieure de la colonne.

Transvaser l'extrait acétonique obtenu en 5.2 sur la colonne, rincer le flacon à plusieurs reprises par de l'acétone (3.1) et transvaser les liquides sur la colonne. Placer un flacon approprié en dessous de la colonne et éluer la furazolidone par de l'acétone (3.1). Le volume total d'acétone à utiliser, y compris le volume ayant servi au rinçage, doit être de 150 ml environ.

5.4. Extraction et mesure de la densité optique

Évaporer l'éluat obtenu en 5.3 jusqu'à sec sur un bain d'eau (4.6). (Occasionnellement, on obtient une petite quantité de diacétone-alcool, produit par condensation de l'acétone sur l'oxyde d'aluminium, qui ne gêne pas les extractions ultérieures.) Dissoudre le résidu dans 10 ml d'alcool amylique (3.4) et transvaser la solution dans une ampoule à décanter (4.2). Rincer le flacon successivement par 10 ml d'acétate d'amyle (3.3) et 10 ml de solution d'urée (3.6), transvaser ces solutions dans l'ampoule à décanter et agiter vigoureusement durant 2 minutes.

Laisser reposer durant 3 à 4 minutes et recueillir ensuite la phase aqueuse dans un ballon jaugé de 100 ml (4.1). Répéter le rinçage et l'extraction à l'aide de quatre portions de 10 ml de solution d'urée (3.6) et recueillir chaque fois la phase aqueuse dans le ballon jaugé. Compléter le contenu du ballon à 100 ml avec la solution d'urée (3.6) et homogénéiser. Mesurer la densité optique de la solution au spectrophotomètre (4.7) à 375 nm par comparaison avec la solution d'urée (3.6). Déterminer la quantité de furazolidone en se référant à la courbe d'étalonnage (5.5).

5.5. Courbe d'étalonnage

Préparer quatre colonnes chromatographiques selon le mode opératoire indiqué en 5.3, premier paragraphe. Introduire à la pipette dans les colonnes des volumes respectifs de 2,5 - 5,0 - 7,5 - et 10,0 ml de la solution étalon (3.8). Éluer chaque colonne par 150 ml d'acétone (3.1) et poursuivre le mode opératoire comme indiqué en 5.4. Tracer la courbe d'étalonnage en portant en ordonnée les valeurs de la densité optique et en abscisse les quantités correspondantes de furazolidone en microgrammes.

6. Calcul des résultats

La teneur en mg de furazolidone par kg d'échantillon est donnée par la formule >PIC FILE= "T0006684">

dans laquelle:

A = quantité en microgrammes de furazolidone déterminée par la mesure photométrique,

P = poids en grammes de la prise d'essai.

7. Répétabilité

La différence entre les résultats de deux déterminations parallèles effectuées sur le même échantillon ne doit pas dépasser:

50 p. cent du résultat le plus élevé pour les teneurs en furazolidone comprises entre 10 et 20 ppm;

10 ppm, en valeur absolue, pour les teneurs comprises entre 20 et 100 ppm;

10 p. cent du résultat le plus élevé pour les teneurs comprises entre 100 et 5 000 ppm;

500 ppm, en valeur absolue, pour les teneurs comprises entre 5 000 et 10 000 ppm;

5 p. cent du résultat le plus élevé pour les teneurs supérieures à 10 000 ppm.