Fourth Commission Directive 73/46/EEC of 5 December 1972 establishing Community methods of analysis for the official control of feedingstuffs
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Directive de la Commissiondu 30 juillet 1981modifiant les directives 71/250/CEE, 71/393/CEE, 72/199/CEE, 73/46/CEE, 74/203/CEE, 75/84/CEE, 76/372/CEE et 78/633/CEE portant fixation de méthodes d'analyse communautaires pour le contrôle officiel des aliments des animaux(81/680/CEE), 31981L0680, 29 août 1981
Directive 92/89/CEE de la Commissiondu 3 novembre 1992modifiant l'annexe I de la quatrième directive 73/46/CEE portant fixation de méthodes d'analyse communautaires pour le contrôle officiel des aliments des animaux, 31992L0089, 26 novembre 1992
Directive 98/54/CE de la Commissiondu 16 juillet 1998modifiant les directives 71/250/CEE, 72/199/CEE, 73/46/CEE et abrogeant la directive 75/84/CEE(Texte présentant de l'intérêt pour l'EEE), 31998L0054, 24 juillet 1998
Directive 1999/27/CE de la Commissiondu 20 avril 1999portant fixation des méthodes communautaires d'analyse pour le dosage de l'amprolium, du diclazuril et du carbadox dans les aliments des animaux, modifiant les directives 71/250/CEE, 73/46/CEE et abrogeant la directive 74/203/CEE(Texte présentant de l'intérêt pour l'EEE), 31999L0027, 6 mai 1999
Règlement (CE) no 152/2009 de la Commissiondu 27 janvier 2009portant fixation des méthodes d'échantillonnage et d'analyse destinées au contrôle officiel des aliments pour animaux(Texte présentant de l'intérêt pour l'EEE), 32009R0152, 26 février 2009
Quatrième directive de la Commissiondu 5 décembre 1972portant fixation de méthodes d'analyse communautaires pour le contrôle officiel des aliments des animaux(73/46/CEE)LA COMMISSION DES COMMUNAUTÉS EUROPÉENNES,vu le traité instituant la Communauté économique européenne,vu la directive du Conseil, du 20 juillet 1970, concernant l'introduction de modes de prélèvement d'échantillons et de méthodes d'analyse communautaires pour le contrôle officiel des aliments des animauxJO no L 170 du 3. 8. 1970, p. 2., modifée par la directive no 72/275/CEE du 20 juillet 1972JO no L 171 du 29. 7. 1972, p. 39., et notamment son article 2,considérant que la directive susvisée prévoit que les contrôles officiels des aliments des animaux, pour constater si les conditions prescrites en vertu des dispositions législatives, réglementaires ou administratives concernant la qualité et la composition des aliments des animaux sont respectées, sont effectués selon des modes de prélèvement d'échantillons et des méthodes d'analyse communautaires;considérant que les directives no 71/250/CEE, no 71/393/CEE et no 72/199/CEE de la Commission, des 15 juin 1971JO no L 155 du 12. 7. 1971, p. 13., 18 novembre 1971JO no L 279 du 20. 12. 1971, p. 7. et 27 avril 1972JO no L 123 du 29. 5. 1972, p. 6., ont déjà fixé un certain nombre de méthodes d'analyse communautaires; que, compte tenu de l'état d'avancement des travaux effectués depuis lors, il convient d'arrêter une quatrième série de méthodes;considérant que les mesures prévues à la présente directive sont conformes à l'avis du Comité permanent des aliments des animaux,A ARRÊTÉ LA PRÉSENTE DIRECTIVE:
Article premierLes États membres prescrivent que les analyses pour les contrôles officiels des aliments des animaux, en ce qui concerne les teneurs en humidité des graisses et des huiles animales et végétales, ainsi que les teneurs en magnésium et en cellulose brute des aliments sont effectuées selon les méthodes décrites à l'annexe I de la présente directive.Les dispositions générales figurant à la partie 1 (introduction) de l'annexe de la première directive no 71/250/CEE de la Commission, du 15 juin 1971, sont applicables aux méthodes décrites à l'annexe I de la présente directive.Article 2Les États membres prescrivent que les analyses pour les contrôles officiels des aliments des animaux, en ce qui concerne leurs teneurs en rétinol (vitamine A), thiamine (aneurine, vitamine B 1), acides ascorbique et déhydroascorbique (vitamine C) sont effectuées selon les méthodes décrites à l'annexe II de la présente directive.Les dispositions générales figurant à la partie 1 (introduction) de l'annexe de la première directive no 71/250/CEE de la Commission, du 15 juin 1971, à l'exception de la partie concernant la préparation de l'échantillon à analyser, sont applicables aux méthodes décrites à l'annexe II de la présente directive.Article 3Les États membres mettent en vigueur, le 1er janvier 1974 au plus tard, les dispositions législatives, réglementaires ou administratives nécessaires pour se conformer aux dispositions de la présente directive. Ils en informent immédiatement la Commission.Article 4Les États membres sont destinataires de la présente directive.nullANNEXE I1.DOSAGE DE L'HUMIDITÉ DANS LES GRAISSES ET LES HUILES ANIMALES ET VÉGÉTALES1.Objet et domaine d'applicationLa méthode permet de déterminer la teneur en humidité (eau et autres matières volatiles) des graisses et des huiles animales et végétales.2.PrincipeL'échantillon est soumis à la dessiccation à 103 °C jusqu'à cessation de la diminution de masse. La perte de masse est déterminée par pesée.3.Appareillage3.1.Récipient à fond plat, en matériau résistant à la corrosion, diamètre: 8 à 9 cm, hauteur: 3 cm environ3.2.Thermomètre à mercure, avec bulbe renforcé, et chambre de dilatation à l'extrémité supérieure, gradué de 80 °C environ à 110 °C au moins, longueur: 10 cm environ3.3.Bain de sable ou plaque chauffante électrique3.4.Dessiccateur, contenant un déshydratant efficace3.5.Balance analytique4.Mode opératoirePeser, à 1 mg près, 20 g environ de l'échantillon homogénéisé dans le récipient (3.1) sec et taré, contenant le thermomètre (3.2). Chauffer sur le bain de sable ou la plaque chauffante (3.3), en agitant constamment à l'aide du thermomètre, de façon que la température atteigne 90 °C en 7 minutes environ.Réduire l'intensité du chauffage en suivant la fréquence avec laquelle les bulles montent du fond du récipient. La température ne doit pas dépasser 105 °C. Continuer à agiter en raclant le fond du récipient jusqu'à cessation de la formation de bulles.Pour assurer l'élimination complète de l'humidité, répéter à plusieurs reprises le chauffage à 103 °C ± 2 °C, en refroidissant à 93 °C entre les chauffages successifs. Laisser refroidir ensuite dans le dessiccateur (3.4) jusqu'à température ambiante et peser. Répéter cette opération jusqu'à ce que la perte de masse entre deux pesées successives n'excède plus 2 mg.N.B.Une augmentation de masse de l'échantillon après chauffage répété indique une oxydation de la graisse. Dans ce cas, calculer le résultat à partir de la pesée effectuée immédiatement avant le début de l'augmentation de masse.5.Calcul des résultatsLa teneur en humidité pour cent d'échantillon est donnée par la formule:M1 - M2 · 100Modans laquelle:Momasse, en grammes, de la prise d'essai,M1masse, en grammes, du récipient avec son contenu, avant le chauffage,M2masse, en grammes, du récipient avec son contenu, après le chauffage.Les résultats inférieurs à 0,05 p. cent doivent être rapportés par la mention "moins de 0,05 p. cent".RépétabilitéLa différence entre les résultats de deux déterminations parallèles effectuées sur un même échantillon ne doit pas dépasser 0,05 p. cent en valeur absolue.2.DOSAGE DU MAGNÉSIUM— par spectrophotométrie d'absorption atomique —1.Objet et domaine d'applicationLa méthode permet de doser le magnésium dans les aliments des animaux. Elle est particulièrement indiquée pour déterminer les teneurs en magnésium inférieures à 5 p.cent.2.PrincipeL'échantillon est incinéré et mis en solution dans l'acide chlorhydrique dilué. S'il ne contient pas de substances organiques, il est mis directement en solution dans l'acide chlorhydrique dilué. La solution est diluée et la teneur en magnésium est déterminée par spectrophotométrie d'absorption atomique à 285,2 nm, par comparaison avec des solutions étalon.3.Réactifs3.1.Acide chlorhydrique p.a., d: 1,163.2.Acide chlorhydrique p.a., d: 1,193.3.Magnésium, en ruban ou en fil, ou sulfate de magnésium MgSO4.7H2O p.a. séché sous vide à la température ambiante3.4.Solution de sel de strontium (chlorure ou nitrate) à 2,5 p.cent (p/v) de strontium (= 76,08 g de SrCl2.6H2O p.a./1 ou 60,38 g de Sr (NO3)2 p.a./1)3.5.Solution étalon de magnésium: peser, à 1 mg près, 1 g de magnésium (3.3), préalablement débarrassé avec soin de sa pellicule d'oxyde, ou une quantité correspondante de sulfate de magnésium (3.3), l'introduire dans un ballon jaugé de 1000 ml, ajouter 80 ml d'acide chlorhydrique (3.1), laisser dissoudre et compléter à 1000 ml par de l'eau. 1 ml de cette solution contient 1,000 mg de magnésium.4.Appareillage4.1.Creusets à incinération en platine, quartz ou porcelaine4.2.Four à moufle électrique, avec thermostat4.3.Spectrophotomètre d'absorption atomique5.Mode opératoire5.1.Mise en solution5.1.1.Aliments constitués exclusivement de substances minéralesPeser, à 1 mg près, 5 g de l'échantillon et les introduire dans un ballon jaugé de 500 ml avec 250 à 300 ml d'eau. Ajouter 40 ml d'acide chlorhydrique (3.1), amener à ébullition et maintenir le liquide en ébullition douce durant 30 minutes. Laisser refroidir, compléter au volume par de l'eau, homogénéiser et filtrer dans un becher sec à travers un filtre à plis sec. Rejeter les 30 premiers ml du filtrat.En présence de silice, traiter 5 g de l'échantillon par une quantité suffisante (15 à 30 ml) d'acide chlorhydrique (3.2) et évaporer à sec sur un bain d'eau. Poursuivre comme indiqué en 5.1.2, à partir de la troisième phrase.5.1.2.Aliments constitués essentiellement de substances minéralesPeser, à 1 mg près, 5 g de l'échantillon dans un creuset à incinération et incinérer à 550 °C au four à moufle jusqu'à obtention de cendres exemptes de particules charbonneuses. Pour éliminer la silice, ajouter aux cendres une quantité suffisante (15 à 30 ml) d'acide chlorhydrique (3.2) et évaporer à sec sur un bain d'eau. Sécher ensuite durant une heure à l'étuve à 105 °C. Reprendre le résidu par 10 ml d'acide chlorhydrique (3.1) et transférer à l'aide d'eau chaude dans un ballon jaugé de 500 ml. Amener à ébullition, laisser refroidir et compléter au volume par de l'eau. Homogénéiser et filtrer dans un becher sec à travers un filtre à plis sec. Rejeter les 30 premiers ml du filtrat.5.1.3.Aliments constitués essentiellement de substances organiquesPeser, à 1 mg près, 5 g de l'échantillon dans un creuset à incinération et incinérer à 550 °C dans un four à moufle, jusqu'à obtention de cendres exemptes de particules charbonneuses. Reprendre les cendres par 5 ml d'acide chlorhydrique (3.2), évaporer à sec sur un bain d'eau et sécher ensuite durant une heure à l'étuve à 105 °C, pour insolubiliser la silice. Reprendre le résidu par 5 ml d'acide chlorhydrique (3.1), transférer à l'aide d'eau chaude dans un ballon jaugé de 250 ml, amener à ébullition, laisser refroidir et compléter au volume par de l'eau. Homogénéiser et filtrer dans un becher sec à travers un filtre à plis sec. Rejeter les 30 premiers ml du filtrat.5.2.Mesure de l'absorption atomiquePréparer, en diluant la solution étalon (3.5) par de l'eau, au moins 5 solutions de référence de concentrations croissantes, choisies en fonction de la zone de mesure optimum du spectrophotomètre. Ajouter à chaque solution 10 ml de solution de sel de strontium (3.4) et compléter ensuite au volume à 100 ml par de l'eau.Diluer par de l'eau une partie aliquote du filtrat obtenu en 5.1.1, 5.1.2. ou 5.1.3 de façon à obtenir une concentration en magnésium comprise dans les limites de concentration des solutions de référence. La concentration en acide chlorhydrique de cette solution ne doit pas dépasser 0,4 N. Ajouter 10 ml de solution de sel strontium (3.4) et compléter ensuite au volume à 100 ml par de l'eau.Mesurer l'absorption de la solution à doser et des solutions de référence à la longueur d'onde de 285,2 nm.6.Calcul des résultatsCalculer la quantité de magnésium de l'échantillon à partir des solutions de référence. Exprimer le résultat en pour cent de l'échantillon.RépétabilitéLa différence entre les résultats de deux déterminations parallèles effectuées sur le même échantillon ne doit pas dépasser 5 p.cent, en valeur relative.3.DOSAGE DE LA CELLULOSE BRUTE1.Objet et domaine d'applicationLa méthode permet de doser, dans les aliments des animaux, les matières organiques exemptes de graisses et insolubles en milieu acide et en milieu alcalin, conventionnellement désignées sous le nom de cellulose brute.2.PrincipeL'échantillon, éventuellement dégraissé, est traité successivement par des solutions bouillantes d'acide sulfurique et d'hydroxyde de potassium de concentrations déterminées. Le résidu est séparé par filtration sur un filtre en verre, lavé, séché, pesé puis calciné entre 475 et 500 °C. La perte de poids résultant de la calcination correspond à la cellulose brute présente dans l'échantillon d'essai.3.Réactifs3.1.Acide sulfurique, c = 0,13 mol/l3.2.Antimousse (n-octanol par exemple)3.3.Adjuvant de filtration (Celite 545 ou équivalent) chauffé à 500 °C pendant 4 heures (8.6)3.4.Acétone3.5.Éther de pétrole (point d'ébullition 40-60 °C)3.6.Acide chlorhydrique, c = 0,5 mol/l3.7.Solution d'hydroxyde de potassium, c = 0,23 mol/l4.Appareillage4.1.Unité de chauffage pour la digestion par des solutions d'acide sulfurique ou d'hydroxyde de potassium. Cette unité est munie d'un support à creuset filtrant (4.2) et pourvue d'un tuyau avec vanne vers le vide et la vidange. Elle est éventuellement pourvue d'air comprimé. Avant chaque utilisation journalière, préchauffer l'unité avec de l'eau bouillante pendant 5 minutes.4.2.Creuset filtrant en verre de 50 ml avec un filtre en verre fritté de porosité 40-90 μm. Avant la première utilisation chauffer à 500 °C pendant quelques minutes et refroidir (8.6).4.3.Cylindre d'au moins 270 ml avec un réfrigérant à reflux, approprié à l'ébullition4.4.Étuve avec thermostat4.5.Four à moufle avec thermostat4.6.Unité d'extraction comprenant un support pour le creuset filtrant (4.2) et un tuyau d'évacuation avec vanne vers le vide et la vidange4.7.Joints pour assembler l'unité de chauffage (4.1), le creuset (4.2) et le cylindre (4.3), et pour connecter l'unité d'extraction (4.6) à froid et le creuset5.Mode opératoirePeser à 0,001 g près 1 g de l'échantillon préparé, le mettre dans le creuset (4.2) (voir observations 8.1, 8.2, 8.3) et ajouter 1 g d'adjuvant de filtration (3.3).Assembler l'unité de chauffage (4.1) et le creuset filtrant (4.2), puis attacher le cylindre (4.3) au creuset. Remplir de 150 ml d'acide sulfurique bouillant (3.1) l'ensemble cylindre-creuset et si nécessaire ajouter quelques gouttes d'antimousse (3.2). Porter le liquide à ébullition en 5 ± 2 minutes et bouillir vivement pendant 30 minutes exactement.Positionner la vanne vers le tuyau de vidange (4.1) et, sous vide, filtrer l'acide sulfurique à travers le creuset filtrant et laver le résidu avec trois fois 30 ml d'eau bouillante, en veillant à ce que le résidu aille à sec après chaque lavage.Fermer la vanne de vidange et mettre 150 ml de solution bouillante d'hydroxyde de potassium (3.7) dans l'ensemble cyclindre-creuset filtrant et ajouter quelques gouttes d'antimousse (3.2). Porter le liquide à ébullition en 5 ± 2 minutes et bouillir vivement pendant exactement 30 minutes. Filtrer et répéter la procédure de lavage comme pour l'acide sulfurique.Après le lavage final et le séchage, disjoindre le creuset et son contenu et le reconnecter à l'unité d'extraction à froid (4.6). Mettre le vide et laver le résidu dans le creuset avec trois portions successives de 25 ml d'acétone (3.4) en veillant à ce que le résidu aille à sec après chaque lavage.Sécher le creuset jusqu'à poids constant à l'étuve à 130 °C. Après chaque séchage, refroidir dans un dessiccateur et peser rapidement. Placer le creuset dans un four à moufle et réduire en cendres jusqu'à poids constant entre 475 et 500 °C pendant au moins 30 minutes.Après chaque chauffage, refroidir d'abord dans le four puis dans le dessiccateur avant de peser.Effectuer un essai à blanc sans l'échantillon. La perte de poids résultant de la minéralisation ne doit pas excéder 4 mg.6.Calcul des résultatsLa teneur en cellulose brute pour cent d'échantillon est donnée par la formule:b - c × 100adans laquelle:amasse de l'échantillon (en g),bperte de masse (en g) à la calcination, lors du dosage,cperte de masse (en g) à la calcination, lors de l'essai à blanc.7.RépétabilitéLa différence entre deux déterminations parallèles effectuées sur le même échantillon ne doit pas dépasser:0,3 dans la valeur absolue pour contenu des fibres brutes plus faible que 10 %,3 % par rapport au résultat plus élevé, pour le contenu des fibres brutes égal ou supérieur à 10 %.8.Observations8.1.Les aliments des animaux contenant plus de 10 % de matières grasses doivent être dégraissés avant analyse par l'éther de pétrole (3.5). Connecter le creuset filtrant (4.2) et son contenu à l'unité d'extraction à froid (4.6), appliquer le vide et laver le résidu avec trois fois 30 ml d'éther de pétrole. S'assurer que le résidu est sec. Connecter le creuset et son contenu à l'unité de chauffage (4.1) et continuer comme décrit en 5.8.2.Les aliments des animaux contenant des matières grasses qui ne peuvent être directement extraites par l'éther de pétrole (3.5) doivent être dégraissés comme en 8.1 puis dégraissés de nouveau après ébullition avec l'acide.Après ébullition avec l'acide et les lavages qui suivent, connecter le creuset et son contenu à l'unité d'extraction à froid (4.6) et laver trois fois avec 30 ml d'acétone et ensuite trois fois avec 30 ml d'éther de pétrole. Filtrer sous vide jusqu'au séchage et continuer l'analyse comme décrite en 5, au niveau du traitement par l'hydroxyde de potassium.8.3.Si l'échantillon contient plus de 5 % de carbonates, exprimés en carbonate de calcium, connecter le creuset (4.2) avec l'échantillon pesé à l'unité de chauffage (4.1). Laver l'échantillon avec trois fois 30 ml d'acide chlorhydrique (3.6). Après chaque addition, attendre environ 1 minute avant de filtrer. Laver une fois avec 30 ml d'eau et puis continuer comme décrit en 5.8.4.Si un appareil en forme de dressoir est utilisé (plusieurs creusets attachés à la même unité de chauffage), ne pas effectuer deux essais du même échantillon dans la même série.8.5.Si, après ébullition, il est difficile de filtrer les solutions acide et basique, utiliser l'air comprimé par le tuyau de vidange de l'unité de chauffage puis continuer la filtration.8.6.La température de calcination ne devrait pas dépasser 500 °C de façon à allonger la durée de vie des creusets filtrants en verre. Prendre soin d'éviter les chocs thermiques pendant les cycles de chauffage et de refroidissement.ANNEXE II1.DOSAGE DU RÉTINOL (VITAMINE A)1.Objet et domaine d'applicationLa méthode permet de doser le rétinol (vitamine A) dans les aliments, les concentrats et les prémélanges. La limite inférieure du dosage est de 10000 UI/kg pour les aliments fortement pigmentés et de 4000 UI/kg pour les autres produits1 UI = 0,3 μg de rétinol.. Les produits y sont classés en deux groupes, selon leur teneur présumée en rétinol:Groupe A: teneurs inférieures à 200000 UI/kg,Groupe B: teneurs égales ou supérieures à 200000 UI/kg.2.PrincipeL'échantillon est hydrolysé à chaud par une solution d'hydroxyde de potassium en milieu éthanolique et en présence d'un antioxygène ou en atmosphère d'azote. Le mélange est soumis à l'extraction par le 1,2-dichloréthane. L'extrait est évaporé à sec et repris parl'éther de pétrole. La solution est chromatographiée sur colonne d'oxyde d'aluminium (pour les produits du groupe B, la chromatographie n'est requise que dans certains cas). Le rétinol est dosé par spectrophotométrie à 610 nm après développement d'un complexe coloré selon la réaction de Carr-Price, dans le cas des produits du groupe A; par spectrophotométrie dans l'UV à 325 nm dans le cas des produits du groupe B.3.Réactifsa)utilisés pour l'analyse des produits des groupes A et B3.1.Éthanol à 96 p.cent (v/v)3.2.Solution à 10 p.cent (p/v) d'ascorbate de sodium p.a., ou3.3.Azote, purifié3.4.Solution à 50 p.cent (p/v) d'hydroxyde de potassium p.a.3.5.Solution d'hydroxyde de potassium 1 N3.6.Solution d'hydroxyde de potassium 0,5 N3.7.1,2-dichloréthane p.a.3.8.Éther de pétrole, pur, ébullition 30—50 °C. Si nécessaire, purifier comme suit. Agiter 1000 ml d'éther de pétrole avec des portions de 20 ml d'acide sulfurique concentré jusqu'à ce que l'acide reste incolore. Éliminer l'acide et laver l'éther successivement par 500 ml d'eau, deux fois 250 ml d'une solution à 10 p.cent d'hydroxyde de sodium et trois fois 500 ml d'eau. Éliminer la couche aqueuse, sécher l'éther durant 1 h sur charbon actif et sulfate de sodium anhydre, filtrer et distiller3.9.Oxyde d'aluminium, standardisé selon Brockmann: calciner durant 8 h à 750 °C, refroidir en dessiccateur et conserver en flacon de verre brun, à bouchon rodé. Avant l'utilisation en chromatographie, humidifier comme suit: introduire dans un flacon de verre brun 10 g d'oxyde d'aluminium et 0,7 ml d'eau, boucher hermétiquement, réchauffer durant 5 minutes dans un bain d'eau bouillante tout en agitant énergiquement. Laisser refroidir en agitant. Vérifier l'activité de l'oxyde d'aluminium ainsi préparé en soumettant à l'analyse selon 5.3 et 5.4 une quantité connue de rétinol étalon (3.17)3.10.Oxyde d'aluminium basique, degré d'activité I3.11.Éther diéthylique, pur. Éliminer les peroxydes et les traces d'eau par chromatographie sur colonne d'oxyde d'aluminium basique (3.10) (25 g d'oxyde d'aluminium pour 250 ml d'éther diéthylique)3.12.Solutions d'éther de pétrole (3.8) à 4, 8, 12, 16 et 20 p.cent (v/v) d'éther diéthylique (3.11)3.13Solution de sulfure de sodium 0,5 mole dans la glycérine à 70 p.cent (v/v), préparée à partir de sulfure de sodium p.a.b)utilisés exclusivement pour l'analyse des produits du groupe A3.14.Benzène p.a., cristallisable3.15.Chloroforme p.a. Éliminer l'éthanol, le phosgène et les traces d'eau par chromatographie sur colonne d'oxyde d'aluminium basique (3.10) (50 g d'oxyde d'aluminium pour 200 ml de chloroforme) il convient de chromatographier une seconde fois les 50 premiers ml d'éluat)3.16.Réactif selon Carr-Price: Agiter 25 g environ de trichlorure d'antimoine p.a. (conservé en dessiccateur) avec 100 ml de chloroforme (3.15) jusqu'à saturation de la solution. Un faible dépôt de trichlorure d'antimoine ne gêne pas. Ajouter 2 ml d'anhydride acétique p.a. Conserver en glacière dans un flacon de verre brun à bouchon rodé. Durée de conservation: plusieurs semaines3.17.Rétinol étalon, contrôlé par spectrophotométriec)utilisés exclusivement pour l'analyse des produits du groupe B3.18.Isopropanol, pour chromatographie4.Appareillage4.1.Bain d'eau4.2.Appareil rotatif à évaporation sous vide, avec ballons ronds de différentes capacités4.3.Tubes pour chromatographie, en verre (longueur: 300 mm, diamètre intérieur: 13 mm environ)4.4.Spectrophotomètre avec cuvettes de 10 mm d'épaisseur (en quartz pour mesures dans l'UV)4.5.Lampe UV, 365 nm5.Mode opératoireN.B.Toutes les manipulations doivent se faire à l'abri de la lumière directe, éventuellement dans un appareillage de verre brun5.1.Prise d'essaiPrélever une prise d'essai de l'échantillon finement divisé, proportionnelle à la teneur présumée en vitamine A, soit:0,1 à 1,0 g pour les concentrats (teneurs supérieures à 20000 UI/g),3,0 à 5,0 g pour les prémélanges (teneurs comprises entre 400 et 20000 UI/g),10 à 20 g pour les mélanges minéraux,30 g pour les produits du groupe A.Introduire immédiatement la prise d'essai dans un ballon de 500 ml à bouchon rodé.5.2.Hydrolyse et extractionPour les aliments d'allaitement et les produits tendant à s'agglomérer ou à gonfler, doubler la quantité des réactifs indiqués sous 5.2 premier et deuxième alinéas.Ajouter successivement à la prise d'essai 40 ml d'éthanol (3.1), 2 ml de solution d'ascorbate de sodium (3.2)L'addition d'ascorbate de sodium n'est pas nécessaire lorsque l'hydrolyse est effectuée en atmosphère d'azote., 10 ml de solution d'hydroxyde de potassium (3.4) et 2 ml de solution de sulfure de sodium (3.13).Chauffer durant 30 minutes à 70-80 °C sous réfrigérant à reflux et laisser ensuite refroidir sous courant d'eau. Ajouter 50 ml d'éthanol (3.1) et 100 ml (prélevés à la pipette) de 1,2-dichloréthane (3.7). Agiter énergiquement et décanter le liquide surnageant dans une ampoule à décanter. Ajouter dans l'ampoule 150 ml de solution d'hydroxyde de potassium (3.5), agiter durant 10 secondes et laisser reposer jusqu'à séparation des phases. Recueillir la phase dichloréthanique (phase inférieure) dans une ampoule à décanter, ajouter 40 ml de solution d'hydroxyde de potassium (3.6), agiter durant 10 secondes et laisser reposer jusqu'à séparation des phases. Recueillir la phase dichloréthanique dans une ampoule à décanter et laver 6 à 8 fois à l'aide de portions de 40 ml d'eau, jusqu'à absence d'alcali (essai à la phénolphtaléine). Recueillir la phase dichloréthanique et éliminer les dernières traces d'eau à l'aide de bandes de papier-filtre.Évaporer à sec une partie aliquote de la solution, sous vide et sur bain d'eau à la température de 40 °C. Reprendre rapidement le résidu par 5 ml d'éther de pétrole (3.8).Pour les produits du groupe A, chromatographier comme indiqué en 5.3.1.Pour les produits du groupe B, transférer la solution dans un ballon jaugé de 50 ml, compléter au volume par de l'éther de pétrole (3.8) homogénéiser et mesurer la densité optique comme indiqué en 5.4.2.5.3.Chromatographie5.3.1.Produits du groupe ARemplir un tube pour chromatographie (4.3), jusqu'à une hauteur de 200 mm, d'oxyde d'aluminium (3.9) préalablement imprégné d'éther de pétrole (3.8). Introduire dans le tube la solution obtenue en 5.2 et ajouter immédiatement20 ml d'éther de pétrole (3.8). Éluer successivement par des portions de 10 ml des solutions d'éther de pétrole à 4, 8, 12, 16 et 20 p.cent d'éther diéthylique (3.12), sous vide partiel ou sous pression, la vitesse d'écoulement étant de 2 à 3 gouttes par seconde.Le carotène est élué en premier lieuLa teneur en carotène peut être déterminée par la mesure de la densité optique à 450 nm; .. Le rétinol est généralement élué par la solution d'éther de pétrole à 20 p.cent d'éther diéthylique (3.12). L'éluation est contrôlée sous lumière UV (brève irradiation de la colonne par une lampe au mercure). La bande fluorescente du rétinol se sépare nettement des bandes jaunes de xanthophylle qui la suivent. Recueillir la fraction de l'éluat contenant le rétinol dans un erlenmeyer.5.3.2.Produits du groupe BLa chromatographie ne doit être effectuée que si les mesures de la densité optique obtenues en 5.4.2 ne sont pas conformes aux prescriptions indiquées en 5.4.2.Si la chromatographie s'avère nécessaire, introduire dans la colonne chromatographique une partie aliquote de la solution dans l'éther de pétrole obtenue en 5.2, contenant environ 500 UI de rétinol, et chromatographier comme indiqué en 5.3.1.5.4.Mesure de la densité optique5.4.1.Produits du groupe AÉvaporer à sec, sous vide, l'éluat contenant le rétinol, obtenu en 5.3.1. Reprendre le résidu par 2 ml de benzène (3.14). Prélever 0,3 ml de cette solution et ajouter 3 ml du réactif selon Carr-Price (3.16). Il se développe une coloration bleue. Mesurer la densité optique au spectrophotomètre à 610 nm, 30 secondes exactement après le début de la réaction. Déterminer la teneur en rétinol, en se référant à une courbe d'étalonnage obtenue à partir de solutions benzéniques de concentrations croissantes en rétinol étalon traitées par le réactif selon Carr-Price (2 à 16 UI de vitamine A étalon (3.17) par 0,3 ml de benzène (3.14) + 3 ml du réactif selon Carr-Price (3.16). La courbe d'étalonnage doit être contrôlée régulièrement et à brefs intervalles de temps à l'aide de l'étalon et d'une solution fraîchement préparée du réactif selon Carr-Price.5.4.2.Produits du groupe BPrélever une partie aliquote de la solution dans l'éther de pétrole obtenue en 5.2, contenant environ 200 UI de rétinol. Évaporer à sec, sous vide, et reprendre le résidu par 25 ml d'isopropanol (3.18). Mesurer la densité optique au spectrophotomètre à 325, 310 et 334 nm. Le maximum d'absorption se situe à 325 nm. La teneur en rétinol A de la solution est calculée comme suit:E325 · 18,30 = UI de rétinolToutefois, les rapports des densités optiquesE310: E325 et E334: E325doivent être de 6 : 7 = 0,857.Si l'un de ces rapports s'écarte sensiblement de cette valeur (<0,830 ou> 0,880), la mesure des densités optiques doit être précédée d'une chromatographie, selon le procédé indiqué en 5.3.2. Si la mesure des densités optiques effectuée après la chromatographie indique que les rapports ci-dessus mentionnés s'écartent encore sensiblement de la valeur 0,857 (<0,830 ou >0,880), le dosage doit être effectué selon le procédé indiqué pour les produits du groupe A.6.Calcul des résultatsCalculer la teneur en rétinol de l'échantillon en tenant compte du poids de la prise d'essai et des dilutions effectuées au cours de l'analyse. Exprimer le résultat en UI de rétinol par kg.RépétabilitéLa différence entre les résultats de deux déterminations parallèles effectuées sur le même échantillon ne doit pas dépasser:20 p.cent, en valeur relative, pour les teneurs en rétinol inférieures à 75000 UI/kg,15000 UI pour les teneurs comprises entre 75000 et 150000 UI/kg,10 p.cent, en valeur relative, pour les teneurs comprises entre 150000 et 250000 UI/kg,25000 UI pour les teneurs comprises entre 250000 et 500000 UI/kg,5 p.cent, en valeur relative, pour les teneurs supérieures à 500000 UI/kg.2.DOSAGE DE LA THIAMINE (ANEURINE, VITAMINE B1)1.Objet et domaine d'applicationLa méthode permet de doser la thiamine (aneurine, vitamine B1) dans les aliments, les concentrais et les prémélanges. La limite inférieure du dosage est de 5 ppm.2.PrincipeL'échantillon est traité à chaud par l'acide sulfurique dilué et hydrolysé ensuite par voie enzymatique. La solution obtenue est soumise à une oxydation alcaline. Le thiochrome formé est extrait par l'isobutanol et dosé par fluorimétrie.3.Réactifs3.1.Solution étalon de thiamine à 100 μg/ml: dissoudre 112,3 mg de chlorhydrate de thiamine très pur, préalablement desséché sous vide jusqu'à poids constant, dans 1000 ml d'acide sulfurique 0,2 N (3.2). Au froid et à l'obscurité, cette solution est stable durant un mois3.2.Acide sulfurique 0,2 N3.3.Métabisulfite de sodium, Na2S2O3, pur3.4.Solution à 20 p.cent (p/v) de ferricyanure de potassium p.a.3.5.Solution à 25 p.cent (p/v) d'hydroxyde de potassium p.a.3.6.Mélange oxydant: mélanger 2 ml de solution de ferricyanure de potassium (3.4) à 48 ml de solution d'hydroxyde de potassium (3.5). Ce mélange ne se conserve pas plus de 4 h3.7.Isobutanol, p.a.3.8.Solution d'acétate de sodium 2,5 N3.9.Préparation multienzymatique contenant de la protéase, de la phosphatase et de l'amylase (par ex. clarase)3.10.Éthanol à 96 p.cent (v/v)4.Appareillage4.1.Bain d'eau4.2.Centrifugeuse (3500 t/m) avec tubes de 30 à 50 ml, munis de bouchons rodés4.3.Fluorimètre5.Mode opératoire5.1.Hydrolyse enzymatiqueIntroduire dans deux ballons jaugés A et B de 250 ml des quantités identiques de l'échantillon finement divisé, contenant 100 μg environ de thiamine et 125 ml d'acide sulfurique (3.2). Ajouter en outre, dans le ballon A seulement, 1,0 ml de solution étalon (3.1) (étalon interne).Agiter vigoureusement, porter les ballons sur un bain d'eau bouillante et les y maintenir durant 15 minutes en agitant de temps en temps. Laisser refroidir jusqu'à 45 °C environ. Ajouter dans chaque ballon 20 ml de solution d'acétate de sodium (3.8) et 0,5 g de préparation multienzymatique (3.9), laisser ensuite reposer durant 20 minutes à la température ambiante. Ajouter 20 ml de solution d'acétate de sodium (3.8), compléter au volume par de l'eau, homogénéiser et filtrer. Recueillir les filtrats A et B après en avoir éliminé les 15 premiers ml. Préparer les solutions suivantes.5.1.1.Solution témoin TIntroduire dans un tube à centrifuger (4.2), 5 ml du filtrat A et 10 mg environ de métabisulfite de sodium (3.3). Plonger le tube durant 15 minutes dans un bain d'eau bouillante et laisser ensuite refroidir jusqu'à température ambiante.5.1.2.Solutions A (étalon interne) et B (échantillon)Introduire 5 ml du filtrat A dans un tube à centrifuger (4.2) et 5 ml du filtrat B dans un autre tube à centrifuger (4.2).5.2.OxydationAjouter aux solutions T, A et B 5 ml du mélange oxydant (3.6) et, après une minute, 10 ml d'isobutanol (3.7). Boucher les tubes et agiter vigoureusement durant 5 secondes. Laisser reposer durant une minute et centrifuger pour séparer les phases. Prélever dans chaque tube 5 ml de la phase isobutanolique surnageante, les introduire respectivement dans des ballons jaugés de 25 ml, compléter au volume par de l'éthanol (3.10) et homogénéiser (= extraits T, A et B).5.3.Mesure de la fluorescenceEffectuer les mesures à la longueur d'onde pour laquelle le fluorimètre donne une réponse optimale à la fluorescence du thiochrome. Irradier à 365 nm environ.Ajuster l'instrument au zéro à l'aide de l'extrait T. Mesurer l'intensité de la fluorescence des extraits A et B.6.Calcul des résultatsLa teneur en μg de thiamine par kg d'échantillon est donnée par la formule:d · ba - b cdans laquelle:aintensité de la fluorescence de l'extrait A (étalon interne)bintensité de la fluorescence de l'extrait B (échantillon)cpoids de la prise d'essai en gdquantité de thiamine en μg ajoutée à la prise d'essai (étalon interne).RépétabilitéLa différence entre les résultats de deux déterminations parallèles effectuées sur le même échantillon ne doit pas dépasser:10 p.cent, en valeur relative, pour les teneurs inférieures à 500 ppm et5 p.cent, en valeur relative, pour les teneurs égales ou supérieures à 500 ppm.3.DOSAGE DE L'ACIDE ASCORBIQUE ET DE L'ACIDE DÉHYDROASCORBIQUE(VITAMINE C)1.Objet et domaine d'applicationLa méthode permet de doser la somme des acides ascorbique et déhydroascorbique (vitamine C) dans les aliments, les concentrats et les prémélanges. La limite inférieure du dosage est de 5 ppm. Les produits y sont classés en deux groupes, selon leur teneur présumée en vitamine C:Groupe A: teneurs inférieures à 10 g/kgGroupe B: teneurs égales ou supérieures à 10 g/kg.2.PrincipeL'échantillon, mis en suspension dans une solution diluée d'acide métaphosphorique, est soumis à l'extraction par le chloroforme. La phase aqueuse est traitée par une solution de 2,6-dichlorophénol-indophénol, pour transformer l'acide ascorbique en acide déhydroascorbique, et ensuite par une solution de 2,4-dinitrophénylhydrazine. L'hydrazone formée est extraite par un mélange d'acétate d'éthyle, d'acide acétique glacial et d'acétone. La solution est chromatographiée sur une colonne de gel de silice, l'éluat est évaporé à sec et le résidu est dissous dans l'acide sulfurique dilué. La densité optique de la solution est mesurée au photomètre à 509 nm.Pour les produits du groupe A, l'éluat, issu de la chromatographie sur colonne, est soumis, en outre, à une chromatographie sur couche mince pour isoler l'hydrazone.3.Réactifs3.1.Solution étalon à 0,05 p.cent d'acide L-ascorbique: dissoudre 50 mg d'acide L-ascorbique p.a. dans 20 ml environ de solution d'acide métaphosphorique (3.2) et compléter à 100 ml par de l'eau. Préparer immédiatement avant l'emploi3.2.Solution à 10 p.cent (p/v) d'acide métaphosphorique: dissoudre dans l'eau 200 g d'acide métaphosphorique p.a., broyés au mortier, et compléter à 2000 ml par de l'eau. Conserver à 4 °C. Renouveler après une semaine3.3.Chloroforme p.a.3.4.Solution à 0,5 p.cent (p/v) de 2,6-dichlorophénol-indophénol p.a. Préparer immédiatement avant l'emploi3.5.Auxiliaire de filtration (S. et S. no 121 ou équivalent)3.6.Solution acide à 2 p.cent (p/v) de 2,4-dinitrophénylhydrazine: dissoudre 2 g de 2,4-dinitrophénylhydrazine dans 100 ml d'acide sulfurique dilué (25 ml d'acide sulfurique p.a., d: 1,84, dilués à 100 ml par de l'eau). Au froid, cette solution se conserve une semaine3.7.Azote, ou3.8.Anhydride carbonique3.9.Mélange d'acétate d'éthyle p.a./acide acétique glacial/acétone p.a.: 96/2/2 en vol3.10.Mélange de dichlorométhane p.a./acide acétique glacial: 97/3 en vol3.11.Gel de silice, granulométrie: 0,05 à 0,2 mm3.12.Gel de silice H, selon Stahl, pour chromatographie sur couche mince3.13.Acide sulfurique dilué: introduire 105 ml d'eau dans un ballon jaugé de 200 ml, compléter au volume par de l'acide sulfurique p.a., d: 1,843.14.Solvant d'élution pour chromatographie sur couche mince: mélanger 75 ml d'éther diéthylique p.a., 25 ml d'acétate d'éthyle p.a. et 4,0 ml d'acide acétique à 96 p.cent (p/v) p.a. Renouveler après 2 à 3 chromatographies4.Appareillage4.1.Bain d'eau réglé à 20 °C par l'ultrathermostat4.2.Centrifugeuse (3500 t/m) avec tubes de 40 à 50 ml, munis de bouchons rodés4.3.Appareil rotatif, à évaporation sous vide, avec ballons de 250 ml4.4.Tubes pour chromatographie, en verre (longueur: 100 mm, diamètre intérieur: 20 mm), avec plaque de verre fritté (par ex. tubes d'Allihn)4.5.Spectrophotomètre ou colorimètre à filtres, avec cuvettes de 10 mm d'épaisseur4.6.Appareillage pour chromatographe sur couche mince, avec plaques de gel de silice (3.12), épaisseur de couche: 0,5 à 0,6 mm (les plaques prêtes à l'emploi conviennent). Sécher les plaques durant 2 h 30 à 3 h dans l'étuve à 120—130 °C. Laisser refroidir et conserver ensuite en dessiccateur durant 24 h au moins avant l'emploi4.7.Étuve, réglée à 120—130 °C.5.Mode opératoire5.1.ExtractionIntroduire dans deux ballons jaugés, A et B, de 250 ml à bouchon rodé, des quantités identiques de l'échantillon finement divisé, contenant 200 μg environ de vitamine C. Ajouter, dans le ballon A seulement, 0,4 ml de solution étalon (3.1) et homogénéiser en secouant légèrement (étalon interne).Ajouter dans chaque ballon 30 ml de chloroforme (3.3) et 25 ml de solution d'acide métaphosphorique (3.2) à 4 °C. Agiter brièvement et laisser ensuite reposer 10 à 15 minutes. Ajouter 25 ml d'eau, boucher les ballons, agiter vigoureusement durant 10 secondes et laisser reposer 10 à 15 minutes dans le bain d'eau (4.1). Centrifuger pour séparer la phase aqueuse de la phase chloroformique. Poursuivre les opérations simultanément sur les extraits aqueux A (étalon interne) et B, comme indiqué ci-après.5.2.OxydationPrélever à la pipette 40 ml de la solution aqueuse surnageante (légèrement trouble) obtenue en 5.1, les introduire dans un tube à réaction à bouchon rodé, ajouter 0,5 à 1 ml de solution de 2,6-dichlorophénol-indophénol (3.4) et homogénéiser. Il se forme une coloration rouge qui doit persister 15 minutes au moins. Ajouter ensuite 300 mg environ d'auxiliaire de filtration (3.5), agiter et filtrer sur un filtre à plis sec. Le filtrat ne doit pas nécessairement être limpide.5.3.Réaction avec la 2,4-dinitrophénylhydrazine et extraction de l'hydrazonePrélever à la pipette 10 ml du filtrat obtenu en 5.2, les introduire dans un tube à centrifuger (4.2), ajouter 2 ml de solution de 2,4-dinitrophénylhydrazine (3.6) et homogénéiser. Faire passer rapidement dans le tube un courant d'azote (3.7) ou d'acide carbonique (3.8), boucher le tube et le plonger durant 15 h environ (une nuit) dans le bain d'eau (4.1). Ajouter ensuite 3 ml d'eau, 20 ml du mélange acétate d'éthyle/acide acétique glacial/acétone (3.9) et 800 mg environ d'auxiliaire de filtration (3.5). Boucher le tube, agiter vigoureusement durant 30 secondes et centrifuger. Introduire 15 ml de la phase surnageante dans un ballon à évaporation et évaporer sous pression réduite dans l'évaporateur rotatif (4.3) jusqu'à obtention d'un résidu huileux. Dissoudre le résidu dans 2 ml du mélange acétate d'éthyle/acide acétique glacial/acétone (3.9) en réchauffant à 50° C, laisser refroidir, ajouter 10 ml du mélange dichlorométhane/acide acétique glacial (3.10) et homogénéiser.5.4.Chromatographie sur colonneRemplir un tube pour chromatographie (4.4) jusqu'à une hauteur de 30 mm, du mélange dichlorométhane/acide acétique glacial (3.10). Mettre en suspension (en agitant vigoureusement) 5 g de gel de silice (3.11) dans 30 ml du mélange dichlorométhane/acide acétique glacial (3.10), verser la suspension dans le tube. Laisser déposer et tasser ensuite sous faible pression d'azote (3.7).Transvaser dans le tube la solution obtenue en 5.3, rincer le ballon avec une petite quantité du mélange dichlorométhane/acide acétique glacial (3.10) et transvaser dans le tube, remplir ensuite celui-ci du mélange (3.10) et poursuivre le lavage de la colonne avec le même mélange (3 à 4 portions de 5 ml environ) jusqu'à obtention d'un éluat incolore. Éliminer la fraction de l'éluat colorée en jaune.Éluer la zone rougeâtre en tête de colonne par le mélange acétate d'éthyle/acide acétique glacial/acétone (3.9), recueillir l'éluat et l'évaporer à sec.5.4.1.Pour les produits du groupe A (teneurs en vitamine C inférieures à 10 g/kg) dissoudre le résidu dans 2,0 ml du mélange acétate d'éthyle/acide acétique glacial/acétone (3.9) et procéder immédiatement à la chromatographie sur couche mince comme indiqué en 5.5.5.4.2.Pour les produits du groupe B (teneurs en vitamine C égales ou supérieures à 10 g/kg), reprendre le résidu huileux par 4,0 ml d'acide sulfurique dilué (3.13), agiter vigoureusement pour dissoudre complètement le résidu et procéder à la mesure de la densité optique comme indiqué en 5.6.5.5Chromatographie sur couche minceEffectuer les opérations indiquées ci-après en double. Déposer sous forme de trait sur la plaque pour chromatographie sur couche mince (4.6) 0,5 ml de la solution obtenue en 5.4.1. Développer durant 20 minutes au moins à l'acide du solvant d'élution (3.14), en cuve saturée, jusqu'à séparation nette de la zone de l'hydrazone colorée en rose. Laisser sécher à l'air. Délimiter la zone rose, racler celle-ci à l'aide d'une spatule et transférer quantitativement la masse pulvérulente dans un tube pour chromatographie (4.4).Éluer successivement une fois par 2 ml et deux fois par 1,5 ml du mélange acétate d'éthyle/acide acétique glacial/acétone (3.9). Recueillir l'éluat dans un petit ballon (la dernière fraction doit être incolore). Évaporer à sec, reprendre le résidu huileux par 4,0 ml d'acide sulfurique dilué (3.13), agiter vigoureusement pour dissoudre complètement le résidu et procéder à la mesure de la densité optique.5.6.Mesure de la densité optiqueMesurer la densité optique au photomètre à 509 nm, 20 à 30 minutes après la mise en solution du résidu dans l'acide sulfurique. Effectuer les mesures par comparaison avec de l'acide sulfurique dilué (3.13).5.7.Essai à blancEffectuer un essai à blanc en appliquant le même mode opératoire en l'absence d'échantillon.6.Calcul des résultatsLa teneur en g de vitamine C par kg d'échantillon est donnée par la formule:c - a · 2b - c · 10 ddans laquelle:adensité optique du blancbdensité optique de la solution de l'étalon internecdensité optique de la solution de l'échantillondpoids en grammes de la prise d'essai.RépétabilitéLa différence entre les résultats de deux déterminations parallèles effectuées sur le même échantillon ne doit pas dépasser 10 p.cent, en valeur relative, pour les teneurs en vitamine C inférieures à 10 g/kg et 5 p.cent, en valeur relative, pour les teneurs égales ou supérieures à 10 g/kg.